颞叶癫疒间大鼠海马轴突导向分子Sema3F及其受体Np2表达的变化

颞叶癫疒间大鼠海马轴突导向分子Sema3F及其受体Np2表达的变化作者：袁学谦，肖波，李玲，唐铁钰，王康，李蜀渝，李国良    作者单位：450003 河南省郑州市第五人民医院神经内科（袁学谦）；中南大学湘雅医院神经内科（肖波,李玲,唐铁钰,王康,李蜀渝,李国良）    【摘要】  目的 研究颞叶癫疒间大鼠海马轴突导向分子Sema3F及其受体Np2表达的变化。方法 给SD大鼠腹腔注射匹罗卡品、氯化锂制作颞叶癫疒间模型。用免疫组化法和原位杂交技术对致疒间后不同时间点大鼠海马CA1区、CA3区、齿状回的Sema3F mRNA、Np2 mRNA和蛋白表达进行检测，并与正常对照组比较。结果颞叶癫疒间大鼠致疒间后7 d、15 d，海马CA1区、CA3区Sema3F mRNA、Np2 mRNA和蛋白的表达明显低于正常对照组（P<0.05～0.01), 致疒间后30 d、60 d表达与正常对照组差异无统计学意义；而齿状回Sema3F mRNA、Np2 mRNA和蛋白的表达与正常对照组的差异无统计学意义。结论 颞叶癫疒间大鼠海马CA1区、CA3区Sema3F、Np2表达在致疒间后早期明显下调，而在慢性期恢复正常。    【关键词】  颞叶癫疒间；轴突导向分子；Sema3F；Np2    Changes of expressions of axon guidance molecule Sema3F and its receptor Np2 in hippocampus of temporal lobe epilepsy rat  YUAN Xueqian,XIAO Bo, LI Ling,et al. Department of Neurology,the Fifth Peoples Hospital of Zhengzhou,Zhengzhou 450003,China    Abstract：Objective  To investigate the changes of expressions of axon guidance molecule Sema3F and its receptor Np2 in hippocampus of temporal lobe epilepsy（TLE）rat.Methods  Rats were injected with Lithiumchloride,Pilocarpine intraperitoneally to establish TLE model.The Sema3F mRNA, Np2 mRNA and protein in areas CA1,CA3 and dentate gyrus (DG) of hippocampus  at different time were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization for TLE models.Further, they were compared with normal control group.Results  Compared with normal control group,the expressions of Sema3F mRNA,Np2 mRNA and protein in areas CA1,CA3 significantly decreased（P<0.05～0.01）at 7 d,15 d after the TLE models established;and they all resumed to normal levels at 30 d,60 d.But there were no significant changes in DG.Conclusion  The expressions of Sema3F, Np2 in areas CA1 and CA3 of TLE rat is down regulation significantly during acute period and resumed to normal during chronic period.    Key words：temporal lobe epilepsy;axon guidance molecule;Sema3F;Np2    颞叶癫疒间的发病机制一直是癫疒间研究的热点。轴突出芽是颞叶癫疒间突出的病理学特点，海马兴奋性异常增高是颞叶癫疒间的电生理学特点。轴突出芽、突触重建与兴奋性增高的形成与维持、疒间性放电的易化与扩散与癫疒间的发生和发展存在着非常紧密的联系［1,2］。已经发现轴突导向分子Sema3F及其受体Np2在脊椎动物中枢神经系统的正常发育过程中发挥了重要作用，并且在成年脊椎动物脑中尤其海马系统内仍有广泛表达，但其是否参与了颞叶癫疒间海马环路内的轴突出芽及突触重建，从而促进了颞叶癫疒间的形成与发展尚不清楚［3,4］。本研究观察颞叶癫疒间大鼠海马Sema3F mRNA及其受体Np2 mRNA和蛋白表达的动态变化，以探讨其在颞叶癫疒间海马轴突出芽、突触重建中可能发挥的作用。现报告如下。1  材料与方法    1.1  动物与分组  6～8周龄健康雄性SD大鼠80只，质量180～220 g；随机分为颞叶癫疒间组（癫疒间组）50只和正常对照组（对照组）30只，两组又各均分为5个不同时间点亚组（制模后1 d、7 d、15 d、30 d、60 d组）。    1.2  方法    1.2.1  动物模型制作  癫疒间组大鼠用氯化锂（125 mg/kg）加小剂量匹罗卡品（10 mg/kg）腹腔注射，对照组大鼠腹腔注射无菌生理盐水125 mg/kg。给药后自然喂养，每天观察大鼠的行为学变化和脑电图描记，根据Racine标准［5］判定癫疒间发作的程度。    1.2.2  组织切片  在预定时间点将每组6只大鼠麻醉后断头取脑，冰冻修材，用冰冻切片机自中脑向前冠状切面连续切片，收集有海马的脑片进行研究。    1.2.3  Sema3F、Np2 mRNA表达检测  Sema3F、Np2 mRNA的表达检测用原位杂交法（试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司），严格按说明书进行操作。    1.2.4  海马Np2蛋白表达检测  用免疫组化漂浮法检测大鼠海马Np2蛋白表达，山羊抗大鼠Np2多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotecnology公司。    1.2.5  图像分析方法  应用HPIAS1000高清晰彩色病理图像分析系统对切片进行图像分析。所有切片分析在同一强度及放大倍数下进行。每只大鼠检测4张切片，测定部位为海马CA1区、CA3区、齿状回。经灰度调节后按设定程序自动测出阳性神经元终末的光密度值，取平均值。    1.2.6  统计学方法  检测数据用均数±标准差(±s)表示。成组设计多个样本均数间的比较用ANOVA检验；两个样本均数间的比较用t检验。使用SPSS 11.0软件进行统计分析。2  结  果    2.1  模型制作结果  颞叶癫疒间组大鼠氯化锂匹罗卡品腹腔注射后，癫疒间模型制作成功38只（76.0%），不成功3只（6.0%，无发作），死亡9只（18.0%）。癫疒间模型大鼠疒间性发作持续6～24 h后进入静止期，在慢性期（30～60 d）大鼠出现自发性发作（2～3次/d）。急性、慢性期癫疒间模型大鼠的EEG上均出现疒间样波。对照组大鼠行为正常，EEG亦未见疒间样波。    2.2  癫疒间组与对照组大鼠海马CA1区、CA3区Sema3F表达的比较  见表1、表2。癫疒间组大鼠海马CA1、CA3区锥体细胞层均有Sema3F表达。致疒间后24 h CA1区、CA3区内Sema3F mRNA的表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；7 d时显著降低（均P<0.01)；15 d时仍明显低于相应对照组（均P<0.05)；在30 d和60 d恢复至对照组水平。    2.3  癫疒间组与对照组大鼠海马CA1区、CA3区Np2表达的比较  见表3、表4。癫疒间组大鼠海马CA1区、CA3区均有Np2表达。在致疒间后24 h，CA1区、CA3区Np2 mRNA表达与对照组相比差异无统计学意义（均P＞0.05）；7 d、15 d时明显低于对照组（P<0.05～0.01)；在30 d和60 d时与对照组相比差异无统计学意义。两组大鼠海马CA1区、CA3区Np2蛋白表达的变化与Np2 mRNA相同。表1  癫疒间组与对照组大鼠不同时间点CA1区Sema3F mRNA表达的比较(注：与对照组比较*P<0.05,△P<0.01 表2  癫疒间组与对照组大鼠不同时间点CA3区Sema3F mRNA的表达比较注：与对照组比较*P＜0.05,△P＜0.01 表3  癫疒间组与对照组大鼠不同时间点CA1区Np2 mRNA表达的比较  注：与对照组比较*P<0.05,△P<0.01表4  癫疒间组与对照组大鼠不同时间点CA3区Np2 mRNA的表达比较 注：与对照组比较*P<0.05    2.4  癫疒间组与对照组大鼠海马齿状回Sema3F、Np2表达的比较  两组大鼠各时间点齿状回颗粒细胞层Sema3F、Np2 mRNA及蛋白均有表达，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。3  讨  论    颞叶癫疒间突出的病理学特点是在海马环路内部如CA1区、CA3区、齿状回等多个部位均发生轴突出芽与突触重建，这些异常突触形成是构成海马内部复发性兴奋性环路的基础，从而易化了疒间性放电的产生与扩散［6］。    轴突导向分子在异常复杂和精确的神经网络形成过程中扮演了至关重要的作用，对轴突的生长方向、聚集成束以及突触形成均发挥了关键性的作用［7］。其既可以产生正效应(吸引)，也可以产生负效应(排斥)；可以位于细胞表面或是细胞外基质, 通过短程作用(接触介导)发挥作用；也可以分泌后扩散，通过建立长程梯度(化学扩散)与生长锥和轴突中的受体发生作用［7］。Sema3F是轴突导向分子中的一种分泌型蛋白，Np2是Sema3F受体复合物中的主要成分，Sema3F分泌后通过化学扩散建立长程浓度梯度与位于生长锥和轴突上的受体Np2产生化学排斥作用［7］。    在颞叶癫疒间，海马CA1区主要病理改变是神经细胞的丢失以及轴突出芽、突触重建。CA3区锥体细胞发出的Schaffer侧支以及CA1区锥体细胞的轴突发生出芽并与其相邻或附近的锥体细胞树突形成新的突触联系。Nadler等［8］研究表明CA1区的轴突出芽和反应性突触重建多在匹罗卡品致疒间后1个月内结束。在正常海马CA1区，锥体细胞分泌的Sema3F对含有Np2受体成分的轴突生长锥具有明显的排斥作用，从而抑制了轴突的出芽及新突触的形成，维持了CA1区结构的稳定。匹罗卡品致疒间后，CA1区Sema3F mRNA的表达下调将引起该区神经元蛋白合成量的降低以及分泌量的减少，同时伴有Np2蛋白表达下调，导致Sema3F对轴突的排斥力降低，从而在CA1区形成了一个有利于轴突出芽、突触重建的环境。    本实验发现CA1区Sema3F及Np2在匹罗卡品致疒间后1周时表达明显下调，1个月时恢复正常；表达变化的时间与CA1区锥体细胞轴突出芽、突触重建的时间窗基本一致。在颞叶癫痫，CA3区也可出现神经细胞的丢失以及轴突出芽、突触重建。在正常情况下，CA3区锥体细胞分泌的Sema3F对含有Np2受体的锥体细胞轴突以及齿状回颗粒细胞发出的苔藓纤维轴突具有强烈的排斥作用，从而抑制其出芽和新突触的形成。在匹罗卡品致痫后，Sema3F、Np2在该区的表达下调将创造一个有利于锥体细胞之间以及锥体细胞-苔藓纤维之间产生新突触的环境。本实验发现Sema3F、Np2在CA3区锥体细胞中均有表达，且Sema3F、Np2在癫疒间发作后1周时表达明显下调，持续1个月左右恢复正常，与CA3区锥体细胞轴突出芽、突触重建的时间窗基本一致［8］。    本研究发现，癫疒间组大鼠的齿状回颗粒细胞层Sema3F、Np2均有表达，但致疒间后各时间点的表达与对照组差异无统计学意义，推测Sema3F、Np2没有参与齿状回内的苔藓纤维出芽。    匹罗卡品致疒间大鼠海马CA1区、CA3区Sema3F、Np2表达下调的确切机制尚不清楚。一种观点认为是由于在癫疒间持续状态过程中异常同步化的神经元群过度放电所致；另一种观点是去传入理论，即癫疒间持续状态后部分神经元丢失而导致其他神经元的传入冲动减少［9］。癫疒间发作后海马CA3区神经元丢失引起Schaffer侧支传入冲动减少以及神经元的过度兴奋是导致海马CA1区、CA3区Sema3F、Np2表达改变的原因。【参考文献】  ［1］Delorenzo RJ, Sun DA, Deshpande LS.Cellular mechanisms underlying acquired epilepsy: the calcium hypothesis of the induction and maintainance of epilepsy［J］. 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