Eotaxin1在真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉中的表达与嗜酸性粒细胞浸润的相关性

　　作者：洪娟,黄建民,林国经　　作者单位：温州医学院附属第一医院耳鼻咽喉科， 浙江 温州 325000;福建医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科， 福州 350001

　　【摘要】目的 观察真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉的组织病理学特点,检测Eotaxin1在真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉中的表达及与嗜酸性粒细胞浸润的相关性,探讨Eotaxin1在真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉发病过程中的作用。方法 收集真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉20例和鼻中隔偏曲矫正术患者代偿性肥大的下鼻甲黏膜15例，用HE染色法观察组织中的嗜酸性粒细胞浸润，免疫组织化学法检测组织中Eotaxin1的表达，比较两组之间的表达差异,分析组织中嗜酸性粒细胞浸润数目与Eotaxin1表达的相关性。结果 ①真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉上皮脱落、鳞状上皮化生现象明显，间质为大量疏松结缔组织，其中可见较多的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞浸润及大量的毛细血管增生，有时可见较多的纤维组织增生，黏膜内未见真菌菌丝和孢子;②Eotaxin1在下鼻甲黏膜上皮细胞中有少量表达，真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉表达Eotaxin1明显增多(P<0.05)，主要由上皮细胞和血管内皮细胞分泌,间质中可见嗜酸性粒细胞和巨噬细胞表达Eotaxin1;③组织中嗜酸性粒细胞浸润数目和Eotaxin1的表达明显相关(P<0.05)。结论 真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉组织呈慢性炎症改变,其中可见较多的嗜酸性粒细胞浸润，真菌可能通过介导Eotaxin1的过量表达，引起嗜酸性粒细胞聚集活化增多，是真菌球型鼻窦炎合并鼻息肉发生的重要因素之一,拮抗Eotaxin1发挥功能可能对其临床防治有意义。

　　【关键词】 鼻窦炎 鼻息肉 嗜酸性粒细胞 嗜酸性粒细胞趋化因子 真菌

　　Relationship between Eotaxin1 expression and eosinophili infiltration in nasal polyps with fungal ball rhinosinusitis

　　HONG Juan, HUANG Jianmin，　LIN Guojing

　　(Department of Otolaryngology, Affiliated First Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, Zhejiang, China;Affiliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China)

　　To explore the histopathological characteristics of nasal polyps with fungal ball rhinosinusitis, and to determine the expression of Eotaxin1 and its relationship with eosinophili infiltration. Methods Twenty cases of nasal polyps with fungal ball rhinosinusitis and fifteen cases of normal inferior turbinate mucosa were enrolled in this study. Immunohistochemical staining for Eotaxin1 protein and HE staining for eosinophils were performed in two groups. Results ① Lost epithelium and squamous metaplasia were usually observed in nasal polyps with fungal ball rhinosinusitis. In the stroma there were a lot of lymphocyte, eosinophil and phagocyte infiltration, sometimes there were a lot of fibrocytes, also there were briskly capillary hyperplasia, but there were no fungi in the nasal mucous. ② Eotaxin1 constitutively expressed in the inferior turbinate mucosa and highly expressed in nasal polyps with fungal ball rhinosinusitis (P<0.05). Eotaxin1 immunoreactivity was mostly determined in the epithelium and vascular endothelial cells. Some eosinophils and phagocytes in the stroma were also identified as Eotaxin1 positive cells; ③ Tissue eosinophilia in nasal polyps with fungal ball rhinosinusitis was associated with the expression of Eotaxin1 protein (P<0.05). Conclusion Fungi are probably responsible for tissue eosinophilia by increasing the Eotaxin1 protein in nasal polyps with fungal ball rhinosinusitis. Eotaxin1 antagonist may contribute to the treatment of nasal polyps with fungal ball rhinosinusitis.

　　Key words: Sinusitis; Nasal polyp; Eosinophil; Eotaxin1; Fungi

　　鼻息肉的病因和发病机制尚不明确，80%的鼻息肉组织中有较多的嗜酸性粒细胞浸润，提示鼻息肉与嗜酸性粒细胞增多有密切关系。研究显示60%～80%的真菌性鼻窦炎患者合并鼻息肉，有学者提出嗜酸性粒细胞增多可能是对真菌的免疫应答[1]。Eotaxin1是一种嗜酸性粒细胞趋化因子，具有强大的选择性趋化激活嗜酸性粒细胞的作用[2]。本研究应用免疫组化方法检测Eotaxin1在真菌球型鼻窦炎合并鼻息肉中的表达，研究其与组织中嗜酸性粒细胞浸润的关系,探讨真菌、Eotaxin1在鼻息肉的发病过程中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料 A组：取20例真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉组织石蜡标本，均为近3年经福建省协和医院和福建省立医院病理科确诊的真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉患者, 男8例,女12例,29～61岁,平均50岁。B组：下鼻甲黏膜15例, 男9例,女6例,16～54岁,平均37岁，为2005年7～10月住院行鼻中隔偏曲矫正术患者的部分代偿性肥大的下鼻甲黏膜,所选患者均无变应性鼻炎、哮喘和严重的全身疾病。离体后将新鲜标本立即置于10%中性福尔马林液固定48h，常规制作成石蜡块。石蜡标本均行3μm厚组织连续切片，HE染色。

　　1.2 主要试剂 兔抗人多克隆嗜酸性粒细胞趋化因子抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，SP超敏试剂盒、DAB(3, 3二氨基联苯胺) 试剂盒、多聚赖氨酸、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水均购于福州迈新生物技术有限公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 HE染色 鼻息肉组织的形态学特点包括组织水肿、上皮杯状细胞增生、基底膜增厚、大量白细胞,特别是嗜酸性粒细胞浸润。真菌球型鼻-鼻窦炎属于非侵袭性真菌性鼻窦炎，其病理学特征是真菌感染局限在鼻窦腔内，呈团块状，黏膜和骨壁内无真菌侵犯,HE染色或六胺银染色观察[2]。高倍镜下可见嗜酸性粒细胞的细胞核多分为两叶，呈眼镜样，胞浆呈深橘红色，其中充满粗大的深红色颗粒(彩图1)。每个标本分别取两张切片，每张切片上随机取5个高倍视野(high power field, HP)(200倍)，计数嗜酸性粒细胞个数，计算平均值。

　　1.3.2 免疫组化 切片脱蜡、水化,经煮沸法行抗原修复后,按SP试剂盒说明书进行染色,DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照，以小鼠支气管黏膜切片作阳性对照。胞浆呈棕黄色者为阳性细胞，选取背景清晰、阳性表达好的切片作统计分析。应用日本Olympus显微镜和图像分析软件(image ProPlus5.1)测定阳性表达总的积分光密度(integrated optical density, IOD)值，每个标本分别取2张切片，每张切片上随机取5个高倍视野(200倍)，取其平均值。

　　1.4 统计学处理 用统计软件SPSS10.0对结果进行统计学分析。采用非参数检验的统计方法,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　真菌球型鼻-鼻窦炎合并鼻息肉上皮脱落、鳞状上皮化生现象明显，间质为大量疏松结缔组织，其中见较多的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞浸润及大量的毛细血管增生，有时见较多的纤维组织增生，黏膜内未见真菌菌丝和孢子。组织旁可在染成粉红色的无定形基质中见钙化灶，高倍镜下见成堆的呈分支状的真菌菌丝和圆形的孢子。正常下鼻甲黏膜中仅见少量的嗜酸性粒细胞,真菌球型鼻鼻窦炎合并鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞浸润明显高于下鼻甲黏膜(P<0.05)。正常下鼻甲黏膜上皮细胞表达少量Eotaxin1，真菌球型鼻鼻窦炎合并鼻息肉组织表达Eotaxin1水平升高(P<0.05),与组织中的嗜酸性粒细胞浸润相关(P<0.05)。鼻息肉组织中Eotaxin1主要表达于上皮细胞和血管内皮细胞，在黏膜下间质中可见嗜酸性粒细胞和巨噬细胞胞浆表达Eotaxin1。数据统计结果。

　　3 讨论

　　近年的研究发现，在慢性鼻窦炎鼻息肉患者鼻腔灌洗液中真菌检出率很高，国内外报道达43%～96%，且与正常对照组鼻腔灌洗液中真菌检出率和真菌类型均无显著性差异，提示真菌可能是鼻腔内正常的寄生菌群[34]。但临床观察和大量的研究表明，真菌在慢性鼻窦炎鼻息肉发病过程中的作用仍不容忽视。本研究结果显示，真菌球型鼻鼻窦炎并发息肉组织学类型大多数属于嗜酸性粒细胞型息肉,并观察到真菌球型鼻鼻窦炎合并鼻息肉组织中上皮脱落、鳞状上皮化生现象明显，间质为大量疏松结缔组织，其中见较多的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞浸润及大量的毛细血管增生，有时见较多的纤维组织增生，黏膜内未见真菌菌丝和孢子,这与刘铭等[5]观察到的结果一致,提示真菌可能作为一种病因，与鼻黏膜慢性炎症改变致息肉样变有关。

　　嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin1是迄今发现的唯一能有效地选择性激活嗜酸性粒细胞的趋化剂。嗜酸性粒细胞趋化因子属于趋化因子CC类亚家族，已发现3种亚型Eotaxin1,Eotaxin2和Eotaxin3。这些嗜酸性粒细胞趋化因子具有相似的功能，通过结合共同的受体：CC趋化因子受体3(CC chemokine receptor 3，CCR3) 选择性趋化激活嗜酸性粒细胞，发挥其效应。嗜酸性粒细胞趋化因子还通过结合受体CCR3激活肥大细胞、Th2淋巴细胞、血管内皮细胞等，在变态反应发生过程中发挥重要作用。研究发现，eotaxin1主要与变态反应早期组织中嗜酸性粒细胞的浸润激活有关，而eotaxin2、eotaxin3主要与晚期(刺激后24小时后)组织中嗜酸性粒细胞的浸润激活有关[67]。国外的研究表明，生理状况下呼吸道上皮细胞表达少量eotaxin1，但在变应性疾病受变应原刺激后，上皮细胞表达eotaxin1增多，同时黏膜固有层中浸润的炎症细胞和成纤维细胞成为eotaxin1的主要来源[2]。Molinaro等[8]通过研究eotaxin1mRNA在鼻息肉中的定位与定量表达,认为鼻息肉中嗜酸性粒细胞浸润增多可能是一种自我扩增的机制,由鼻息肉中已经存在的嗜酸性粒细胞产生eotaxin1，吸引更多的嗜酸性粒细胞进入鼻息肉组织中。

　　鼻息肉组织高表达eotaxin1，高选择性结合嗜酸性粒细胞膜表达的CCR3，激活Gα蛋白，引起胞内钙离子浓度短暂升高，激活胞内不同的蛋白激酶完成信号传导，趋化嗜酸性粒细胞至高表达区域，激活嗜酸性粒细胞分泌多种毒性蛋白、过氧化物、白三稀等，引起上皮损伤、间质水肿，在鼻息肉的发生过程中发挥着重要作用。研究显示，CCR3单克隆抗体可在一定程度上阻断变应性鼻炎患者的鼻黏膜匀浆诱导的嗜酸性粒细胞跨鼻黏膜微血管内皮细胞的移动，因此拮抗CCR3可能成为治疗变应性鼻炎的一种有效手段[9]。张志明等[10]的研究表明，以链格孢属真菌诱导的小鼠变应性鼻炎模型中鼻黏膜表达eotaxin1mRNA明显增多。本研究应用免疫组化方法检测eotaxin1在真菌球型鼻-鼻窦炎并发息肉中的表达，发现eotaxin1主要表达于上皮细胞和血管内皮细胞，在黏膜下间质中可见嗜酸性粒细胞和巨噬细胞胞浆表达eotaxin1;与下鼻甲黏膜比较，真菌球型鼻鼻窦炎并发息肉组织中eotaxin1表达明显升高，其表达水平与组织中的嗜酸性粒细胞浸润程度明显相关，提示真菌感染导致局部免疫反应，eotaxin1过量表达可引起嗜酸性粒细胞进一步聚集，成为真菌球型鼻-鼻窦炎并发息肉的重要因素。

　　真菌球型鼻鼻窦炎较常见的致病真菌是曲霉菌。曲霉菌是条件致病菌,只在机体抵抗力下降或某一部位(如鼻窦)抵御侵袭能力降低时致病。致病的曲霉菌主要有烟色曲霉菌和黑色曲霉菌,可单种曲霉菌感染,亦可两种曲霉菌或两种以上曲霉菌合并感染。Pitzurra等[11]体外细胞培养研究发现，嗜酸性粒细胞有较强的吞噬真菌静止孢子的能力，而中性粒细胞有较强的杀灭真菌中有侵袭力的菌丝的能力。真菌种属和炎症细胞类型存在特异性,不同的真菌对不同的炎症细胞刺激激活作用不同，如链格孢属真菌诱导嗜酸性粒细胞的活化，释放一系列毒性蛋白，但未能诱导中性粒细胞活化;而有些真菌种属如杂色曲霉菌和白色念珠菌不能诱导嗜酸性粒细胞的活化[12]。本研究未对真菌球型鼻-鼻窦炎的致病真菌作培养和鉴定，有待进一步研究来探讨真菌种属与鼻息肉发病间的关系。特异体质患者接触真菌孢子或菌丝产生特异性抗真菌抗原的免疫球蛋白,可引起速发型及迟发型哮喘反应，此时可发生肥大细胞颗粒脱落及嗜酸性粒细胞浸润[13]。真菌球性鼻-鼻窦炎合并鼻息肉组织中有大量的嗜酸性粒细胞浸润,这是否与真菌致敏特异性体质的机体发生变态反应有关，尚需进一步研究。

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