快速老化小鼠的听功能和耳蜗螺旋神经元的增龄性变化

　　作者：刘强和,罗香林,耿宛平,陈晨　　作者单位：桂林医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科， 广西 桂林 541001

　　【关键词】 快速老化小鼠;听觉脑干反应阈值;螺旋神经元;凋亡

　　LIU Qianghe1, LUO Xianglin1, GENG Wanping1, CHEN Chen2, LEI Xun1, LIU Fangxian1, DENG Ming1

　　(1. Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery, Affiliated Hospital of Guilin Medical College,

　　Guilin 541001, China; 2. Prince Henry′s Institute of Medical Research, Department of

　　Physiology of Monash University, Victoria 3168, Australia)

　　To determine agerelated spiral ganglion neuron damages and hearing loss in the senescence accelerated mice. Methods The auditory thresholds and the morphological changes of the spiral ganglion neurons were studied in senescence accelerated mouse/prone 1 (SAMP 1) mice of 1, 3, 5, 7 and 9 months. Normal aging senescence accelerated mouse/resistance 1 (SAMR 1) mice served as the control group. 8?kHz threshold of auditory brainstem response was determined, transmission electron microscopy and terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) dUTP nick end labeling(TUNEL) were used to observe the auditory function changes, the morphological changes and the immunohistochemical changes. Results Auditory function: Compared with the SAMR 1 mice, SAMP 1 mice of 7 or 9 months developed a progressive hearing loss at 8kHz，which showed an agerelated significant increase(P<0.05). Morphological observation: The SAMR 1 mice had no apoptosis in the spiral ganglion neurons (SGNs), while the SAMP 1 mice of 7 or 9 months developed a significant apoptosis in the SGNs. TUNEL observation: Negative immunohistochemical reaction for TUNEL staining was found in the SGNs in the SAMR 1 mice of 7 months, and a positive reaction was found in the nucleolus of the part of the SGNs of the SAMP 1 mice of 7 months. The image analysis showed that the percentage of positive SGNs of the SAMP 1 mice of 7 months was significantly higher than that of the SAMR 1 mice of 7 months. Conclusions SAMP 1 mice can be used for investigating mechanism of auditoryfunctionaging and as a pertinent animal model of presbyacousis.

　　Key words: Senescence accelerated mouse; Threshold of the auditory brain stem response; Spiral ganglion neuron; Apoptosis 快速老化小鼠包括快速老化小鼠亚系(senescence acceleratedprone mouse,SAMP) 和抗快速老化小鼠亚系(senescence acceleratedresistant mouse，SAMR) 两种品系[1]，是一种近交系衰老模型鼠。SAMP 1 是SAMP的一个亚系，寿命约为12个月，其正常生长期约4～6 月龄，然后迅速出现老化特征;SAMR 1是SAMR的一个亚系，基本表现为正常衰老，可作为SAMP 的正常对照。2007年1月至2008年2月，我们从听觉脑干反应阈值、耳蜗螺旋神经元改变等方面研究，考察SAMP 1小鼠听功能的增龄性变化,旨在初步判定该动物作为老年聋动物模型的可靠性。

　　1 资料与方法

　　1.1 实验动物及处理 所用快速老化小鼠包括SAMP 1和SAMR 1两种品系。其中1、3、5、7、9月龄SAMP1各6只，雌雄各半，作为实验组;同时，选条件相同的同龄SAMR1小鼠各6只，雌雄各半，作为正常对照组。

　　1.2 听功能评价 采用听觉脑干反应(Keypoint型,听觉诱发反应仪)评价每组动物的听功能。2%戊巴比妥钠(45?mg/kg)麻醉后用银针电极经皮下记录反应信号，实验在隔音屏蔽室内进行。刺激声为8?kHz短纯音，声刺激持续时间10?ms，间歇期100?ms，上升/下降时间为1?ms，叠加512次，滤波频率为100～3?000?Hz，刺激重复率20次/s。刺激声强度从100?dB SPL开始，以10?dB递减，至接近反应阈值时以5?dB递减，至刚好出现波形，再重复一次波形能重复即可判断为ABR听阈值;如果短纯音100?dB不能获得听阈，我们就认为其阈值是105?dB。

　　1.3 耳蜗标本预处理 各组动物行ABR阈值测定完毕后，依次用生理盐水、4%的多聚甲醛PBS固定液(0.1，pH7.4,Sigma)经左心室进行半身灌注处死(钳夹腹主动脉)，断头，分别游离左右侧听泡。解剖显微镜下在同种固定液中打开听泡，蜗尖钻孔，将听泡全部切除，剔除听骨及鼓膜，开放圆窗膜，再置于同种固定液中4?℃冰箱中过夜。第2天将标本取出，0.1?M pH7.4 PBS缓冲液反复冲洗，放入10%乙二胺四乙酸(pH7.4)中连续脱钙7?d。

　　1.4 电镜制样观察 已脱钙的右侧耳蜗标本充分冲洗;2.5%戊二醛固定24?h;2%俄酸后固定2?h;梯度丙酮脱水;环氧树脂和纯丙酮混合液浸泡24?h;耳蜗标本轴位包埋成块;修块、定位、轴位半薄切片;超薄切片;电子染色：醋酸铀、硝酸铅双重染色;透射电镜(H600型,日立)观察、照片。

　　1.5 耳蜗石蜡切片制作、TUNEL染色、图像分析 取7月龄SAMP 1小鼠跟同龄SAMR 1小鼠左侧耳蜗标本充分冲洗、脱水、浸蜡,轴位包埋。轴位切片，厚度6～7?μm，于低倍光学显微镜下观察控制切片制作。耳蜗石蜡切片的TUNEL染色按细胞凋亡检测试剂盒操作说明操作(武汉博士德生物有限公司)。细胞凋亡检测试剂盒内容：标记缓冲液(Labeling Buffer)1?mL;末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT，×20)20?μL;地高辛标记的dUTP(DIGdUTP，×20)20?μL;封闭液(blocking Reagent)4?mL;生物素化抗地高辛抗体(×100)20?μL;链酶亲合素-过氧化酶(SABC，×100)20?μL;Proteinase K(×200)50?μL。耳蜗石蜡切片的TUNEL染色方法：①中轴位耳蜗石蜡切片脱蜡、水化;②消除内源性过氧化物酶活性;③Proteinase K 消化;④切片标本加标记液(含TdT及DIGdUTP)标记，阴性对照切片仅加标记缓冲液，37?℃标记2?h;⑤封闭液封闭30?min;⑥生物素化抗地高辛抗体，37?℃反应30?min;⑦加SABC 37?℃反应30?min;⑧3,3，二氨基联苯胺盐酸盐显色，光学显微镜下掌握，且三组切片须同时中止显色;⑨苏木素轻度复染、梯度酒精上行脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。光学显镜下观察，数码拍照。细胞核内有棕黄色或黄色颗粒或斑片者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞，用图像分析系统(GM2000,北航)对每一张免疫组织化学切片在10×4倍下分别随机选3个耳蜗螺旋神经节，所选螺旋神经节分别于10×40倍下测定所有SGNs TUNEL染色阳性率，输出数据为SGNs TUNEL染色阳性率。

　　1.6 统计学处理 各月龄SAMP 1和同龄SAMR 1小鼠听阈、以及7月龄SAMP 1和SAMR 1小鼠耳蜗中轴位切片SGNs TUNEL染色阳性率用±s表示，各组间均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 12.0统计软件，于Windows XP下操作。

　　2 结 果

　　2.1 各组小鼠的听功能改变 改变数据。nABR听阈(dB SPL)(±s)(n=6) 1月龄3月龄5月龄7月龄9月龄对照组630.0±4.4730.8±2.0430.8±3.7632.5±2.7445.0±3.16实验组630.0±4.4729.2±4.9231.7±4.0848.3±6.06*67.5±5.24*

　　*2.2 耳蜗螺旋神经元形态学检测 SAMR 1小鼠和SAMP 1小鼠耳蜗螺旋神经元均以Ⅰ型神经元为主，有完整的髓鞘包绕，有时可见卫星细胞的核;Ⅰ型神经元神经元核大，染色质分布较均匀，核仁明显，常在核膜附近，核膜清晰，有时可出现凹陷，神经元胞浆中细胞器丰富;Ⅱ型细胞小、而且数目少。同时，1、3、5、7、9月龄SAMR 1小鼠、以及5月龄前SAMP 1小鼠罕见螺旋神经元损伤，(7月龄SAMR 1)。而第7、9月龄SAMP 1小鼠可见部分耳蜗螺旋神经元髓鞘崩解，神经元核体积变小;并可见凋亡的SGNs：神经元细胞核体积缩小，染色质浓缩、边集，但细胞器形态仍保持正常(7月龄SAMP 1)。

　　7月龄SAMR 1小鼠耳蜗螺旋神经元(源自耳蜗底回，×8?000)7月龄SAMP 1小鼠耳蜗耳蜗螺旋神经元(源自耳蜗底回，×8?000)

　　2.3 耳蜗中轴位切片TUNEL染色 7月龄SAMP 1和SAMR 1小鼠耳蜗中轴位石蜡切片SGNs的TUNEL染色结果镜下观。7月龄SAMP 1和SAMR 1小鼠耳蜗中轴位切片SGNs TUNEL染色阳性率分别为(11.36±4.96)%和(2.27±2.43)%，两者之间的染色阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。7月龄SAMR 1小鼠耳蜗中轴位切片TUNEL染色(源自耳蜗底回，SABC×400)

　　3 讨 论

　　老年性聋是指因听觉系统老化而引起的耳聋，是一种与机体衰老过程密切相关的局部表现之一，既与其他组织器官的老化息息相关, 也有自己的独特性。一般认为，随着年龄增长，听力都有不同程度的缓进性减退,但其病因、细胞和亚细胞水平的改变、以及其真正的分子机制目前尚不完全清楚。

　　经过听阈检测，我们的研究结果显示，在增龄过程中，SAMP 1和SAMR 1小鼠听觉功能出现减退，而且SAMP 1的增龄性听力丧失明显早于SAMR 1;第7、9月龄SAMP 1小鼠跟同龄SAMR 1小鼠比较听觉脑干反应阈值明显升高。同时，应用作为确定细胞凋亡金标准的电镜形态学观察，我们相应地发现，7、9月龄SAMP 1小鼠耳蜗螺旋神经元出现凋亡现象，而同龄SAMR 1小鼠罕见耳蜗螺旋神经元凋亡。而应用TUNEL技术并且结合图像分析进行半定量检测，我们观察到7月龄SAMR 1小鼠耳蜗螺旋神经元凋亡率与7月龄SAMP 1小鼠耳蜗螺旋神经元凋亡率差异有统计学意义。这与大多数学者[25]认为的人类及动物老化时ABR阈值升高、而且这种变化与耳蜗的组织病理变化相一致的观点相符。

　　随着老龄人群在人口结构中比例的逐渐增加，对老年性聋病因的分子机制、以及细胞和亚细胞水平的改变的探讨研究日趋活跃[68]。但是，对于其耳蜗细胞凋亡如何发生、真正的分子机制如何等问题，都还无法完全解释，因此，寻找一种理想的老年性耳聋动物模型显得尤为重要。SAM属近交系小鼠，有SAMP和SAMR两种品系。SAMP增龄过程中出现许多与衰老相关的功能紊乱，其许多病理学特征与人类衰老时的病理学特征非常相似;SAMR作为抗快速老化亚系，其各项生理指标及平均生存期限均与正常动物相似，因此，目前在大量研究中以SAMR作为SAMP系的正常对照[1]。我们的研究显示，在增龄过程中，SAMP 1听觉功能快速出现减退，而且SAMP 1的增龄性听力丧失明显早于SAMR 1;同时，增龄过程中SAMP 1耳蜗出现与听功能变化相一致的组织病理变化“-”即耳蜗螺旋神经元发生凋亡，此改变与人类衰老时耳蜗形态学改变相似。因此，SAMP 1可以作为研究老年性耳聋的动物模型。

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