慢性化脓性中耳炎病原菌对氟喹诺酮类耐药机制的研究进展

　　作者：倪建军(硕士研究生),沈宝茗　　作者单位：湖南 衡阳,南华大学附属第一医院耳鼻喉科

　　【摘要】慢性化脓性中耳炎是耳鼻喉科常见病，非手术治疗主要以全身和局部应用抗菌药为主，在目前应用的药物中，以氟喹诺酮类疗效最好，但随着该药物的广泛应用，耐药率逐渐上升，本文介绍了慢性化脓性中耳炎常见病原菌对氟喹诺酮类药物耐药机制的相关研究。

　　【关键词】慢性化脓性中耳炎;病原菌;氟喹诺酮类;耐药;研究进展

　　慢性化脓性中耳炎是中耳粘膜、骨膜甚至骨质的持续性或复发性化脓感染的疾病，可累及乳突或咽鼓管，部分患者尚可发展成胆脂瘤。本病发病率较高，尤以儿童更多见。一般认为急性化脓性中耳炎后2至3个月尚未痊愈者，即为慢性。但有时急性症状可不明显，起病隐袭。其临床特点是，患者有经常性或间歇性耳漏、鼓膜穿孔和耳聋。听力减退可以为中耳传音结构被破坏所致传导性聋，也可以为细菌性或感染破坏耳蜗所致的感音性聋。严重者，还可引起颅内外并发症，甚至危及生命[1]。常见的致病菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌及变形杆菌[2～3]，有时可呈两种以上细菌的混合感染。在局部应用的滴耳剂中，由于喹诺酮类药物的毒副作用少、易吸收、易保存等特点，已成为目前治疗慢性化脓性中耳炎最常用的药物。

　　1 喹诺酮类抗菌药与细菌的耐药性

　　1962年研制成功第1代喹诺酮类，现已很少使用。1973年合成第2代药物，对大多数革兰阴性菌有效，但因血中游离药物浓度低，而尿中药物浓度高，故仅用于尿路感染和肠道感染。80年代以来研制的第三代喹诺酮类称为氟喹诺酮类(也有文献将90年代后期以来研制的氟喹诺酮类命名为第4代喹诺酮类)。常用氟喹诺酮类包括诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、氟罗沙星、司氟沙星、莫西沙星、吉米沙星、加替沙星等。喹诺酮类是以4—喹诺酮(或称吡酮酸)为基本结构的合成类抗菌药。在4—喹诺酮母核的N1、C3、C6、C7、C8引入不同的基因，形成各具特点的喹诺酮类。其属广谱杀菌药，其杀菌浓度相当于MIC的2至4倍。90年代后期研制的氟喹诺酮类如莫西沙星等，除保留了原有氟喹诺酮类对大多数革兰阳性菌和革兰阴性菌的良好抗菌活性外，进一步增强了对革兰阳性菌的作用;对结核分枝杆菌、军团菌、支原体及衣原体的杀灭作用也进一步增强;特别是提高了对厌氧菌等的抗菌活性，并显示出良好的临床效果。氟喹诺酮类抗菌机制主要是抑制DNA回旋酶和拓扑异构酶IV。

　　耐药性分为固有耐药性与获得耐药性两种。固有耐药性是指基于药物作用机制的一种内在的耐药性。获得耐药性是指某种细菌对某种抗菌药不具有固有耐药性，其耐药基因是后天获得的。使用抗菌药是形成获得耐药性的重要原因之一，也是抗菌药物临床应用中的一个严重问题。我们平常所说的耐药性即指获得耐药性。包括以下几种机制:(1)降低外膜的通透性：革兰阴性菌细胞膜发生变化，膜孔蛋白的数量减少或孔径减少，导致细菌对药物通透性的降低;(2)产生灭活酶：细菌产生改变药物结构的酶;(3)改变靶位的结构：降低靶蛋白与抗菌药的亲和力或增加靶蛋白的数量或合成与抗菌药亲和力低但具有靶蛋白相同功能的替代蛋白;(4)药物主动外排系统活性增强：使药物的排出速度大于药物的内流速度，降低药物在菌体内的浓度;(5)改变代谢途径;(6)细菌生物膜的形成[4]。

　　2 常见病原菌对氟喹诺酮类的耐药机制

　　由于近年来氟喹诺酮类的广泛应用，细菌的耐药性逐渐增加，本类药物间有交叉耐药。细菌可因gyrA基因突变导致A亚基与药物的亲和力下降;亦可因外膜膜孔蛋白Ompf的基因失活，导致膜通道关闭，喹诺酮类无法通过通道进入菌体。此外，有些细菌含有norA蛋白，并在胞浆膜上形成特殊的转运通道，可将喹诺酮类自菌体内泵出，norA蛋白基因过量表达时，形成耐药菌。常见病原菌的具体耐药机制分别综述如下。

　　2.1 金黄色葡萄球菌

　　2.1.1 改变靶位的结构

　　金黄色葡萄球菌拓扑异构酶IV是细菌生长所必需的酶，由1对C亚基和1对E亚基组成，分别由grlA和grlB基因编码。氟喹诺酮类药物可与DNA复制及转录过程中形成的DNA—拓扑异构酶IV复合物相结合，形成氟喹诺酮类药物—DNA—拓扑异构酶IV复合物，从而阻止DNA分子与拓扑异构酶IV的分离，使DNA复制停止而造成细菌的死亡[5],金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类药物的耐药性主要是由于这些靶酶的基因位点突变引起靶酶空间结构的变异，从而影响氟喹诺酮类药物与靶酶的结合，进而使金葡菌逃逸其杀灭作用，这些靶酶基因统称为氟喹诺酮类药物耐药基因(QRDR)[6]。国外一些研究者发现，当金葡菌的氟喹诺酮类耐药性增加时，grlA基因发生突变，突变局限在氨基酸残基64-103区域，被认为是grlA上的多药耐药区[7-8]。金葡菌DNA拓扑异构酶IV的A亚基grlA80、84位氨基酸残基的突变可致低水平耐药，即单一的突变只能导致低水平耐药，而高水平耐药则需要grlASer80→Phe、Ser80→Tyr和Ser84→Leu、Ser84→Ala、Glu88→Lys等多位点的突变。Fanaka发现在金葡菌氟喹诺酮类药物耐药菌株中存在一些grlB亚基的突变，如Asp432→Asn,Pro451→Ser,Asn470→Asp等，其中与金葡菌耐药关系最为密切的是432的突变[9]。有一些研究者发现，在金葡菌氟喹诺酮类耐药菌株中存在一些grlB基因的突变，如Glu422→Asp, Asp432→Gly,Pro451→Ser等，但这些突变与金葡菌耐药性的关系不明确[10]。

　　2.1.2 药物主动外排系统活性增强

　　NorA外排泵是最早发现的金葡菌氟喹诺酮类药物的外排泵，是跨膜质子梯度能量驱动型外排泵，可利用质子藕联交换产生的质子驱动力外排多种化学结构不同的底物，从而降低细胞内该物质的浓度。NorA蛋白是由388个氨基酸分子组成，相对分子质量为42385u，是多药外排转运蛋白，具有逆质子梯度主动外排氟喹诺酮类药物及多种结构近似甚至无关的物质的功能。NorA蛋白具有将亲水性氟喹诺酮类药物如诺氟沙星、环丙沙星等自菌体内主动外排的功能，而对疏水性喹诺酮类药物如萘啶酸、奥利羧酸和司帕沙星等没有作用，可能由于NorA蛋白形成的通道与亲水性氟喹诺酮类药物的亲和力较大，而疏水性氟喹诺酮类药物不能有效地利用该通道。

　　2.2 铜绿假单胞菌

　　大量研究表明，铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要包括以下方面：(1)改变靶位的结构 DNA促旋酶是由两对亚基GyrA和GyrB组成，分别由GyrA和GyrB基因编码。Kukeishi等[11]首先报道了GyrA基因的突变，发现GyrA的序列有以下3种突变方式：Asp87→Asn、Asp87→Tyr及Thr83→Ile。Yonezawa等[12]又发现了3种新的双点突变现象，即Thr83→Ile和Asp87→Gly、Thr83→Ile和Asp87→Asn、Thr83→Ile和Asp87→His。之后，Takenouchi等[13]发现了GyrA的7种错义方式，其中有2种新的双点突变，即Ala67→Ser和Asp87→Gly、Ala84→Pro和Glu106→Leu。但Thr83→Ile仍为最重要的突变方式，并与氟喹诺酮类的高度耐药有关。(2)药物主动外排系统活性增强 到目前为止共报道了7类铜绿假单胞菌的主动外排泵系统，MexAB-Oprm[14]、MexCD-OprJ[15]、MexEF-OprN[16]、MexXY-OprM[17]、MexJK-OprM[18]、MexHI-OpmD[19]和MexWV-OprM[20],它们均由3个部分组成：○A外膜蛋白：OprM等，形成门通道。○B内膜蛋白：MexB等，为主要的泵出蛋白，具有识别药物的作用，但不具有特异性。○C膜融合蛋白：MexA等，连接内外膜蛋白。它们有各自的调节基因。高水平的氟喹诺酮类耐药株一般均有主动外排泵突变产生。(3)降低外膜的通透性 铜绿假单胞菌外膜通透性降低的原因主要是与外膜上孔道蛋白的结构与状态有关，其次也与孔道蛋白的数量减少有关。(4)生物膜形成 生物膜是指细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，将自身包绕其中形成的膜样物，其主要成分是藻酸盐。它是细菌为适应环境而采取的一种生存策略，可以保护细菌逃逸宿主免疫和抗菌药物的杀伤作用。铜绿假单胞菌生物膜的耐药机制较为复杂：○A胞外多糖被膜能阻止和妨碍抗生素渗入生物膜底层细胞;○B胞外多糖被膜含有较高浓度的抗生素降解酶。○C位于多糖被膜深部的菌细胞很难获得充足的养分和氧气，代谢低下，对各种刺激不再敏感。○D因抗生素无法杀灭底层菌细胞，使其有足够时间开启抗生素耐药基因等。

　　2.3 表皮葡萄球菌 其耐药主要与药物外排泵系统活性增强机制有关。

　　2.4 变形杆菌

　　其耐药机制主要为改变药物作用靶位、外排泵系统活性增强及降低外膜通透性。这些机制均有染色体介导，不会发生耐药基因的水平传播。变形杆菌作为慢性化脓性中耳炎的一种常见致病菌，其较为特殊的耐药机制是含有质粒介导的耐药决定基因(qnr),qnr基因是由于结合质粒介导的喹诺酮类耐药基因，作用机制是其编码的蛋白质对喹诺酮类药物靶位点的保护，从而导致药物治疗的失败。Martinez[21]认为qnr单独作用仅导致喹诺酮类抗菌药物低水平耐药，他的临床重要性在于含qnrA的菌株在喹诺酮类药物的选择压力下容易发生染色体突变，使染色体突变导致的高水平耐药株更加容易被选择出来。

　　3 结 语

　　慢性化脓性中耳炎的常见致病菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌。由于近年来氟喹诺酮类滴耳剂它们对氟喹诺酮类的耐药机制是多方面的，其中以靶位改变最为重要，在高水平的耐药菌株中，外排泵的作用同样重要，鉴于目前对氟喹诺酮类耐药菌株的不断增多，很有可能存在其他耐药机制，有必要对其耐药机制作进一步研究，从而对指导临床合理用药，开发新一代氟喹诺酮类药物提供理论依据。

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