银杏叶提取物对脑缺血再灌注大鼠P选择素表达及髓过氧化物酶活性的影响

银杏叶提取物对脑缺血再灌注大鼠P选择素表达及髓过氧化物酶活性的影响作者：李浩，刘开祥，俸军林，唐永刚，齐立    作者单位：541002桂林医学院附属医院神经内科    【摘要】  目的 探讨银杏叶提取物（GBE）对缺血再灌注损伤大鼠脑组织P选择素表达及髓过氧化物酶（MPO）活性的影响。方法 将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、GBE低剂量组和GBE高剂量组；用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型；GBE高、低剂量治疗组于术前30 min分别给予相应剂量GBE腹腔注射，缺血再灌注组相同时点给予等量的生理盐水腹腔注射。用免疫组化法观察缺血90 min再灌注24 h后大鼠脑组织P选择素表达、MPO活性变化；并进行TTC和HE染色，观察脑梗死体积及组织病理学变化。结果 （1）与假手术组比较，缺血再灌注组及GBE高、低剂量组P选择素表达和 MPO活性明显增加（均P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，GBE高、低剂量组P选择素表达及MPO活性显著降低（均P＜0.05）；GBE高剂量组较低剂量组减少更显著（P＜0.05）；(2) GBE高、低剂量组和缺血再灌注组脑梗死体积分别为（109.2±9.34）mm3、（132.0±15.41）mm3和（191.6±10.92）mm3，3组间两两比较差异有统计学意义（均P＜0.05）；（3）GBE高、低剂量组脑组织缺血损伤病理学改变明显轻于缺血再灌注组，GBE高剂量组缺血改变亦轻于低剂量组。结论 GBE通过减少P选择素表达和中性粒细胞浸润、减轻脑缺血再灌注损伤炎症反应、缩小脑梗死体积而发挥脑保护作用，并且有剂量依赖性。    【关键词】  缺血再灌注；P选择素；髓过氧化物酶；银杏叶提取物    Effects of Gingkgo biloba extra on expression of  Pselectin and myeloperoxidase activity following cerebral ischemiareperfusion injury in rats  LI Hao,LIU Kaixiang,FENG Junlin,et al.Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical College ,Guilin 541002,China    Abstract：Objective  To approach the effects of Gingkgo biloba extra (GBE) on expression of  Pselectin and myeloperoxidase(MPO) activity of cerebral ischemiareperfusion injury in rats. Methods  The rats were randomly divided into sham operated group, ischemiareperfusion group, low dose GBE group and high dose GBE group. The models of  ischemiareperfusion were established by  focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) method.Rats were given high or low dose GBE intraperitoneally, 30 min before MCAO. The expression of Pselectin was tested by  immunohistochemistry and the MPO activity by  chromatometry in the rat brain . The volume of cerebral infarction and the pathologic changes were observed by HE staining and TTC staining . Results  (1) Compared with sham operated group , the expression of Pselectin and MPO activity were increased in models of ischemiareperfusion(allP＜0.05). Compared with ischemiareperfusion group, low and high dose GBE  groups  were reduced dosedependently expression of Pselectin  and MPO activity (allP＜0.05). (2) Compared with ischemiareperfusion group ［(191.6±10.92) mm3 ］, the cerebral infarction volume of low dose GBE group［（132.0±15.41）mm3］ and high dose GBE group［(109.2±9.34)mm3］ were decreased dosedependently (all P＜0.05). (3) The ischemic impairment of brain in low and  high dose GBE groups were significantly lighter than that in ischemiareperfusion  group,and high dose GBE  group was significantly lighter than that in low dose GBE  group. Conclusion  GBE may obviously reduced infarction size and cerebral ischemiareperfusion inflammation injure by decreasing the expression of Pselectin and neutrophils infiltration to play neuroprotective effect on cerebral ischemia injury in dosedependent.    Key words：ischemiareperfusion; Pselectin; myeloperoxidase;Gingkgo biloba extra    炎症反应与脑缺血再灌注损伤密切相关,炎症反应的中心事件是中性粒细胞的浸润、聚集,P选择素是中性粒细胞聚集的起始因素。有研究［1］发现，银杏叶提取物(GBE)可减轻肾脏缺血再灌注后P选择素的表达及中性粒细胞的浸润。本研究通过应用GBE（德国Dr.Willmar Schwabe 药厂出品）预处理，观察其对脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织P选择素表达及髓过氧化物酶（MPO）活性的影响，探讨GBE的脑保护机制。1  材料与方法    1.1  材料  健康Wistar大鼠60只，雄性，清洁级，质量（250±30）g，由广西医科大学动物实验中心提供。按随机分组原则将大鼠分成假手术组、缺血再灌注组、GBE低剂量组及GBE高剂量组，每组15只。    1.2  方法    1.2.1  给药方法  GBE低剂量组（5 mg/kg）和高剂量组（15 mg/kg）大鼠分别于制模前30 min给予相应剂量的GBE腹腔注射1次；缺血再灌注组给予等量的生理盐水腹腔注射；假手术组不予给药。    1.2.2  动物模型的建立  参照Longa等［2］线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。将各组大鼠麻醉后行左侧大脑中动脉栓塞（MCAO）。线栓直径约0.27 mm，插入深度约18 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。假手术组除不插入线栓外，余操作相同。再灌注24 h按照 Longa等［2］评分标准进行神经功能缺陷评分。0分：正常；1分：不能完全伸展右前肢；2分：右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈；3分：行走向右侧跌倒、不能站立或打滚；4分：无自发活动，有意识障碍。1～3分为模型成功，0分和4分予剔除。后续实验中补足每组动物数。    1.2.3  脑组织切片制作  实验动物缺血再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，麻醉后用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌注固定，断头取脑。在左侧大脑半球距嗅球尖端7～11 mm之间冠状切取约5 mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成腊块，连续切片，片厚5 μm。每只动物连续取5张切片，1张用于HE染色，4张用于免疫组化染色。    1.2.4  脑组织P选择素表达的检测  选用上述切片，用SP法进行P选择素的免疫组化染色。一抗由武汉博士德生物工程公司提供，阴性对照片用PBS液代替一抗。在显微镜下观察，以血管内皮细胞表面出现棕黄染色代表P选择素阳性血管。高倍镜下分别随机选取左侧大脑半球计数5个不重复视野P选择素阳性血管数。    1.2.5  脑组织MPO活性的测定  实验动物缺血再灌注24 h后，各组随机取5只大鼠，深麻醉后开颅取脑，冰浴下取左侧大脑半球缺血组织，以试剂盒 (南京建成生物工程研究所)提供的匀浆介质制成脑组织匀浆。严格按试剂盒说明书步骤要求进行操作，计算MPO活力。    1.2.6  脑梗死体积计算  再灌注24 h将各组另5只大鼠深麻醉后开颅取脑并置－4℃冰箱20 min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2％TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。经TTC染色，脑梗死灶区呈白色，正常组织呈红色。应用计算机病理图像分析仪及梯形法计算出梗死灶体积，各脑片梗死灶体积之和即为梗死体积。    1.2.7  脑组织病理学观察  取再灌注24 h鼠脑切片行常规HE染色，光镜下观察脑组织病理学变化。    1.2.8  统计学方法  数据以均数±标准差(±s)表示, 用SPSS 11.5软件，组间比较用F分析。2  结  果    2.1  各组脑组织P选择素表达比较  见表1、图1～3。假手术组未见P选择素阳性血管。缺血再灌注组缺血侧微血管内皮细胞表面可见P选择素表达，主要分布于额顶部皮质和基底节区；两GBE组P选择素表达较缺血再灌注组明显减少（均P＜0.05）; 高剂量组较低剂量组减少更明显（P＜0.05）。表1  各组脑组织P选择素表达、MPO活性及脑梗死体积的比较  注：与缺血再灌注组比较*P＜0.05；与GBE低剂量组比较△P＜0.05；与假手术组比较▲P＜0.05    2.2  各组MPO活性的比较  见表1。制模后各组缺血侧脑组织MPO活性较假手术组明显升高（均P＜0.05）；两GBE组较缺血再灌注组明显降低（均P＜0.05），GBE高剂量组较低剂量组降低更明显（P＜0.05）。    2.3  各组脑梗死体积的比较  见表1、图4。两GBE组梗死体积较缺血再灌注组显著减小（均P＜0.05），其中高剂量组显著小于低剂量组（P＜0.05）。    2.4  各组缺血侧脑组织病理学改变的比较  见图5～8。假手术组脑组织切片可见神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，锥体细胞核大而圆，核仁明显。缺血再灌注组梗死区细胞结构不清，间质水肿，有炎细胞浸润；锥体细胞体积缩小，细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红，部分细胞坏死，并可见呈筛状坏死灶。两GBE组脑组织缺血改变较缺血再灌注组明显减轻，坏死范围缩小，细胞结构较完整，细胞核固缩少，细胞间质水肿轻，GBE高剂量组缺血改变较GBE低剂量组更轻。    图1  缺血再灌注组缺血侧脑组织见较多P选择素阳性血管（SP ×400）  图2  GBE低剂量组P选择素阳性血管较缺血再灌注组减少（SP ×400）  图3  GBE高剂量组P选择素阳性血管较缺血再灌注组和GBE低剂量组少（SP ×400）  图4  大鼠脑组织TTC染色  （A:缺血再灌注组；B:GBE低剂量组；C:GBE高剂量组） GBE高、低剂量组梗死体积较缺血再灌注组减小,GBE高剂量组梗死体积较低剂量组小    图5  假手术组神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，锥体细胞核大而圆，核仁明显（HE ×200）  图6  缺血再灌注组脑组织正常结构不清，间质水肿，锥体细胞体积缩小，细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红，部分细胞坏死（HE ×200）  图7  GBE低剂量组脑组织缺血改变较缺血再灌注组明显减轻，细胞结构完整，细胞核固缩少，间质水肿轻（HE ×200）  图8  GBE高剂量组与GBE低剂量组比较缺血改变更轻（HE ×200）3  讨  论    急性脑梗死梗死灶局部发生炎性反应已被众多的研究［3］证实。炎性反应中性粒细胞聚集需要细胞黏附分子的桥梁作用，P选择素是细胞间黏附分子之一，其合成并储存于血小板的α颗粒和内皮细胞的WeibelPalade小体内，这些部位在静息状态下不表达P选择素。脑缺血时产生大量的细胞因子包括α肿瘤坏死因子（αTNF）等促进P选择素表达，诱导中性粒细胞在微血管内皮细胞上滚动黏附,在其他细胞黏附分子的协助下,穿出血管壁进入脑实质,导致缺血区脑组织损伤。MPO主要存在于中性粒细胞的噬天青颗粒中，MPO活性反映中性粒细胞在脑组织中浸润程度。本研究发现，MCAO术后大鼠缺血再灌注损伤24 h时，P选择素表达主要分布于缺血侧额顶部皮质和基底节区微血管内皮细胞表面，表达水平极显著高于假手术组。缺血侧脑组织MPO活性明显增加，提示脑缺血再灌注损伤出现了中性粒细胞参与为标志的炎性反应过程。    GBE为第4代银杏叶提取物的标准制剂，其中含有24％的黄酮甙和6％的萜类（银杏内酯和白果内酯），具有防止细胞内的钙超载与脑细胞的损伤，拮抗兴奋性氨基酸毒性和自由基损伤，减少缺血再灌注的细胞凋亡，改善血液流变学等脑保护作用。有研究［3］发现，GBE能显著下调脑缺血再灌注后细胞间黏附分子1及其mRNA的表达，减轻脑缺血后炎性病理损害；还有研究［4］发现，GBE能抑制脑缺血后中性粒细胞对缺血脑组织的浸润。本研究结果也提示，经GBE预处理的大鼠脑组织P选择素的表达及MPO活性较缺血再灌注组明显降低，脑梗死体积减小，且GBE高剂量组的上述作用更显著；表明GBE具有减轻脑缺血再灌注损伤脑组织的炎性反应及局部中性粒细胞浸润，并与剂量有关。【参考文献】  ［1］张万帆，杨吉乡，谢守霞，等.银杏叶提取物抗鼠肾缺血再灌注损伤及对P选择素表达的影响［J］.中国临床药理学与治疗学，2004，9：785.  ［2］Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al. 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