囊泡单胺转运体在人胚胎脑组织中的分布特征及其与帕金森病的关系

囊泡单胺转运体在人胚胎脑组织中的分布特征及其与帕金森病的关系作者：田向阳    作者单位：223300南京医科大学附属淮安第一医院神经内科    【摘要】  目的 探讨囊泡单胺转运体（VMAT2）在人胚胎脑组织中的分布特征及其与帕金森病（PD）的关系。方法 分别收集不同胎龄自然流产的新鲜胎儿脑组织，应用免疫组织化学方法和Western blot观察VMAT2 和酪胺酸羟化酶（TH）在胎脑黑质致密部、腹侧被盖部和蓝斑分布的变化。结果 免疫组织化学及Western blot显示， VMAT2在胎脑黑质致密部中的分布既少于腹侧被盖也少与蓝斑（均P<0.05）。结论 胎脑VMAT2在黑质致密部中的分布少于腹侧被盖和蓝斑，黑质致密部保护作用薄弱可能是PD黑质多巴胺能神经元选择性受损的重要原因之一。    【关键词】  帕金森病 囊泡单胺转运体 免疫组织化学 酪胺酸羟化酶 人胚    Feature of distribution of vesicular monoamine transporter in human embryonic brain  and their relationship with Parkinsons disease  TIAN Xiangyang, DING Xinsheng, MIN Min,et al. Department of Neurology, Huaian First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Huaian 223300, China    Abstract：Objective  To investigate the feature of distribution of vesicular monoamine transporter(VMAT2) in human embryonic brains and their relationships with Parkinson disease.Methods  The distribution of VMAT2 and tyrosine hydroxylase (TH) in substantia nigra pars compacta(SNC), ventral tegmental ares(VTA) and locus coeruleus(LC) were  examined by immunohistochemical staining and Western blot in human spontaneous abortion embryonic brains of different gestational age.Results  The distribution of VMAT2 in SNc was less than that in both VTA and LC（all P<0.05）. Conclusion  The amount of VMAT2 that has protective effect on the dopamine(DA) neurons in SNC is less than that in both VTA and LC.The week of the protecting function of VMAT2 in SNC may be one of the important cause of the selective DA neurons lose.    Key words：Parkinson disease；VMAT2；immunohistochemistry；tyrosine hydroxylase；human embryo    帕金森病（PD）是一种进行性神经变性疾病，其特征性病理改变是中脑黑质致密部和纹状体多巴胺(DA)能神经元选择性变性丢失，但病因迄今未明。近来研究［1］发现囊泡单胺转运体（VMAT2）可能在PD发病机制中起了关键作用。为此，本研究通过观察VMAT2在人胚胎脑组织中的分布特征，以探讨其与PD的关系。1  材料与方法    1.1  材料  收集不同胎龄自然流产的新鲜胎儿10例，胎龄3个月2例，4个月2例，5个月3例，6个月2例,7个月1例。酪胺酸羟化酶（TH）单克隆抗体购自美国Sigma公司，VMAT2多克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供。    1.2  方法    1.2.1  标本处理  将上述新鲜胎儿开胸经主动脉用生理盐水冲洗后，用4%多聚甲醛PBS灌注固定，然后取出脑组织，分别留取胎脑黑质致密部（SNC）、腹侧被盖部（VTA）和蓝斑部（LC）的组织作为观测标本，将其浸入4℃的4%多聚甲醛PBS后固定24 h，经常规梯度乙醇脱水和石蜡包埋。    1.2.2  免疫组织化学  所有标本进行切片，片厚4 μｍ，粘附于载玻片上；切片常规脱蜡以及经梯度乙醇脱水。用3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，正常血清工作液封闭非特异性抗原，分别将1∶80稀释的VMAT2多抗和1∶100稀释的TH单抗滴加于切片上，4℃冰箱过夜。染色应用免疫组化SP法，用二甲基联苯胺作为色素原显色，苏木素复染。阴性对照：用PBS代替一抗，余步骤同前。阳性结果为细胞质和突起着棕褐色。    1.2.3  图像分析  用LEICA图文分析系统对阳性区域平均灰度值进行测定和阳性细胞计数，所有测定均在高倍视野下进行。灰度值愈小,说明其免疫染色强度愈高，此物质含量亦愈高。    1.2.4  Western blot检测  取各部位脑组织100 mg抽提蛋白质，Bradford 法定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳。电转移至硝酸纤维素膜，封闭加1∶800稀释的VMAT2多抗, 孵育后加二抗HRP(辣根过氧化酶)IgG (1∶1000稀释)，DAB显色。以吸光度积分(A)表示VMAT2的相对表达量。    1.2.5  统计学方法  结果均用SPSS10.0统计软件进行分析，数据用均数±标准差(±s)表示，采用t检验，P<0.05具有统计学意义。2  结  果    2.1  胎脑SNC、VTA和LC部VMAT2的分布比较  结果显示VMAT2在SNC（153.05±5.22）中的分布少于VTA（130.07±5.55）和LC（118.80±4.79）（均P<0.05）。见图1～3。    图1  VMAT2在胚胎脑组织SNC的表达分布（SP×200）  图2  VMAT2在胚胎脑组织LC的表达分布（SP×200）  图3  VMAT2在胚胎脑组织VTA的表达分布（SP×200）    2.2  胎脑在SNC、VTA和LC部VMAT2和TH免疫组化染色结果  胎脑在SNC、VTA和LC部VMAT2阳性细胞数分别为（123.06±13.89）、（164.13±14.24）、（141.40±13.53）个/高倍视野；胎脑在SNC、VTA和LC部TH阳性细胞数分别为（124.67±13.57）、（166.13±14.53）、（144.33±16.73）个/高倍视野。各部位VMAT2和TH免疫组化染色阳性细胞数之间差异无统计学意义（均P>0.05）。    2.3  胎脑SNC、VTA和LC部VMAT2蛋白表达比较Western blot结果显示VMAT2蛋白在SNC(3245±698)的表达明显低于VTA(4053±953)和LC（6031±732）（均P<0.05）。    2.4  胎脑中DA神经元形态学表现  3个月和4个月胎龄的胎脑VMAT2和TH免疫染色阳性细胞的胞体呈圆形,胞浆少、胞核相对较大, 细胞轮廓欠清晰；随着胎龄的增大，细胞的胞体以梭形、锥形为主，胞体增大，胞浆明显增多, 细胞轮廓较清晰，有较明显的突起。见图4、5。3  讨  论    PD发病机制有多种学说，但这些学说都不能很好地解释PD的DA神经元的选择性受损和病程的进行性发展。近来，神经递质转运体成为神经科学界研究的热点。转运体失调学说能较好地解释SNC DA能神经元选择性缺失机制，而VMAT2可能在PD发病机制中起了关键作用。VMAT2是一种质子依赖性转运体，它能将细胞胞浆中的单胺类神经递质转运聚集在突触囊泡内。VMAT2转运的递质包括DA、去甲肾上腺素、组胺和5羟色胺等，它可以被一些药物所抑制，如利血平、丁苯那嗪和酮色林等［2］。    由于神经毒素1甲基4苯基四氢吡啶(MPTP)可以在人和灵长类动物产生与PD患者相似的临床症状，已被用于制备PD的动物模型。MPTP代谢的毒性产物为1甲基4苯基吡啶（MPP+），它能选择性地抑制SNC DA能神经元内的线粒体的功能，使其产生ATP的功能受损，从而导致SNC DA能神经元变性缺失［3］。VMAT2可将MPP+运入囊泡内,使其不能对囊泡外的细胞物质产生毒性作用，起到防止DA能神经元变性的作用，可见VMAT2对于防止PD的恶化，改善其预后具有重要的意义［4］。另有研究［5］表明，VMAT2基因敲除小鼠出生后不久即死亡。    影像学技术如正电子发射计算机断层扫描（PET）技术和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）技术，使得其对区别疾病的不同阶段的神经元量的变化能力有了很大的提高，然而这些技术空间分辨力较差，而且会受到某些非特异性配体干扰［6］。免疫组织化学及Western blot使用特异性的VMAT2多抗可以对VMAT2进行定位和定量的检测。有研究［7］表明，在PD小鼠模型脑组织中VMAT2在SNC中的分布少于VTA和LC。本实验对VMAT2在人胚胎脑组织中的分布特征进行了探讨。结果发现VMAT2在人胚胎脑组织SNC中的分布既少于VTA，也少于LC部。因此，通过本研究，可以更合理地阐明PD选择性损伤和病程进行性发展的特点。SNC保护作用薄弱可能是PD黑质DA神经元选择性受损的重要原因［4］。此外，通过VMAT2在人胚胎脑组织中分布特征的研究，推测SNC VMAT2减少可能存在先天性因素。    一般认为，TH阳性细胞可作为DA能神经元特异性标志物，在本实验中，可以观察到无论在SNC还是在LC和VTA的VMAT2和TH阳性细胞数之间比较，差异均无统计学意义。因此，VMAT2阳性细胞的检测结果可与TH阳性细胞一样作为DA能神经元特异性标志物，并可作为PD动物模型是否成功的病理检测指标之一。本研究胚胎脑组织DA能神经元形态学表现为:3个月和4个月胎龄的DA能神经元的胞体呈圆形,胞浆少、胞核相对较大，细胞轮廓欠清晰；随着胎龄的增大（6个月），细胞的胞体以梭形、锥形为主,胞体增大,胞浆明显增多, 细胞轮廓较清晰，有较明显的突起，并可见多极神经元。目前，使用人胚胎干细胞移植治疗PD已成为热点，另外，本实验结果还提示: 胎龄<3个月和4个月胚胎的黑质DA神经元为不成熟细胞,临床上用胎龄<3个月和4个月胚胎的黑质DA神经元作为移植供体应比较适宜。【参考文献】  ［1］叶民，丁新生,董海蓉，等.转基因CHO细胞中VMAT2抗毒性作用的研究［J］. 临床神经病学杂志，2002，15：69.  ［2］ Peter D,Jimenez J,Liu Y,et al.The chromaffin granule and synaptic vesicle amine transporters differ in substrate recognition and sensitivity to inhibitors［J］.J Biol Chem,1994,269:7231.  ［3］Speciale SG.MPTP insights into parkinsonian neurodegeneration［J］. Neurotoxicol Teratol,2002,24:607.  ［4］ Liu YJ,Peter D,Roghani A, et al. A cDNA that suppresses MPP+ toxicity encodes a vesicular monoamine transporter［J］.Cell,1992,70:539.  ［5］Fumagalli F,Gainetdinov RR,Wang YM,et al. Increased methamphetamine neurotoxicity in heterozygous vesicular monoamine transporter 2 knockout mice［J］.J Neurosci,1999,19:2424.  ［6］Miller GW,Erickson JD,Perez JD,et al.Immunochemical analysis of vesicular monoamine transporter protein in Parkinson′s disease［J］.Experimental Neurology ,1999,156:138.