变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎鼻黏膜成纤维细胞中组胺受体蛋白

　　作者：崔哲洙,刘艳丽,崔春莲,金顺吉　　作者单位：延边大学附属医院 耳鼻咽喉科，吉林 延吉

　　【摘要】[目的]观察鼻黏膜成纤维细胞中是否存在组胺受体蛋白的表达，并比较在变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎鼻黏膜成纤维细胞中的表达程度.[方法]用流式细胞仪在TNFα，IL1β刺激下比较变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组鼻黏膜成纤维细胞组胺受体蛋白的表达.[结果]可见少量的组胺受体蛋白表达，变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组鼻黏膜成纤维细胞组胺受体蛋白表达量间无显著性差异.[结论]在TNFα，IL1β刺激下变应性鼻炎鼻黏膜成纤维细胞组胺受体蛋白的表达量稍低于慢性单纯性鼻炎.

　　【关键词】 鼻炎,变应性,季节性;受体,组胺;黏膜;鼻;成纤维细胞

　　Expression of histamine receptor protein in fibroblasts of nasal mucosa in allergic rhinitis and chronic simple rhinitis

　　CUI Zhezhu, LIU Yanli, CUI Chunlian， JIN Shunji*

　　(Department of Otorhinolaryngology, Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China)

　　ABSTRACT:OBJECTIVETo investigate whether or not expression of histamine receptor protein (HRP) in fibroblasts of nasal mucosa, and then to compare the difference of expression between allergic and chronic simple rhinitis.METHODSUsing flow cytometry, the exprssion of HRP under the stimulation with TNFα and IL1β in fibroblasts of nasal mucosa was compared between allergic rhinitis and chronic simple rhinitis groups. RESULTSA little of HRP was expressed in fibroblasts of nasal mucosa, and expression of HRP was not significantly different between allergic rhinitis and chronic simple rhinitis groups.CONCLUSIONUnder the stimulation with TNFα and IL1β, the expression of HRP in the nasal fibroblasts is slightly lower in allergic rhinitis than in chronic simple rhinitis.

　　Key words:rhinitis,allergic,seasonal;receptors,histamine;mucous membrane;nose;fibroblasts

　　组胺对细胞与组织起到不同的生理作用，是引起变应性鼻炎主要症状的细胞因子，而组胺的这种功能是通过与细胞表面的组胺受体的结合而完成的.目前，所了解的组胺受体蛋白共有4种类型，分别为1，2，3，4型，分布于很多组织及细胞中.成纤维细胞在人体组织中维持组织结构的作用，并可分泌多种化学趋化因子，如IL8，CMCSF，eotaxin，IL1，IL6等，成纤维细胞的分泌功能由炎症过程中产生的IL1，TNFα等激发[1].Kim等[2]认为，用组胺刺激变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎的鼻黏膜成纤维细胞时，可使其早期分泌更多的CMCSF与stem细胞因子，提示鼻黏膜成纤维细胞中有组胺受体蛋白表达.本研究了解鼻黏膜成纤维细胞中是否存在组胺受体蛋白，并比较在IL1β，TNFα刺激下变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎组织内鼻黏膜成纤维细胞中组胺受体蛋白的表达程度.

　　1 对象及方法

　　1.1 对象 选择变应性鼻炎及慢性单纯性鼻炎患者各5例作为研究对象.变应性鼻炎患者的诊断均符合1997年中华医学会耳鼻咽喉科学分会海口会议诊断标准[3]，具体方法为患者有打喷嚏、搔痒感、流清鼻涕及鼻塞等鼻部症状的同时行MAST(HITACHI chemical nondetectable diagnostics, Inc)检查结果为2级以上，解释评价呈高或以上，粉尘螨或屋尘螨的皮肤过敏反应检查(allergic skin test， AST)及鼻部诱发反应检查(nasal provocation test, NPT)呈阳性者;有鼻涕及鼻塞等鼻部症状，但经MAST，AST及NPT检查均呈阴性者诊断为慢性单纯性鼻炎.所有患者术前2周内均禁用激素及抗组胺药物，无吸烟史.

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 行鼻中隔手术时切取部分下鼻甲黏膜培养成纤维细胞，用含有500U/mL青霉素、500mg/L链霉素及6mg/L fungizon(GIBCO,Grand Island, NY, USA)的PBS洗3次，将黏膜切成体积为1mm3的小块，放置于培养皿内，室温下放置5min，使之贴壁.添加含有100g/L FBS的Dulbeco’s Modified Eagle’s(DMEM, GIBCO, Grand Island, NY, USA)培养液，形成单层成纤维细胞后除去培养液，用PBS洗涤后添加0.5g/L胰蛋白酶EDTA，在37℃，50mL/L二氧化碳培养箱内培养5min，消化组织细胞并使细胞分离.将分离的细胞置于含有20g/L FBS及抗生素的DMEM培养基内进行传代培养.将培养液分别滴入到6孔培养皿中，每孔为1mL，细胞数为3×105个.

　　1.2.2 成纤维细胞的刺激 向含有20g/L FBS的培养基中分别添加10μg/L IL1β， 10μg/L TNFα(R&D Systems, MN, USA)，各培养24h，行蛋白表达测定.

　　1.2.3 流式细胞仪检测 用PBS将培养皿内成纤维细胞洗2次，用0.5g/L胰蛋白酶EDTA在37℃条件下处理5min.置于100g/L FBS培养基中，并在1200r/min，4℃条件下离心5min.用冷PBS洗2次，添加稀释20倍的2型组胺受体蛋白1次抗体(Chemicon, Temecula, CA, USA),在4℃条件下反应1h.待反应结束后再用冷PBS洗2次，加入FITC结合抗体(Chemicon, Temecula, CA, USA) 反应1h,添加稀释5000倍的2次抗体,于4℃条件下反应1h，再用冷PBS洗2次,进行FACS测定.用上述方法培养变应性鼻炎及慢性单纯性鼻炎鼻黏膜成纤维细胞后，用IL1β(10μg/L)，TNFα(10μg/L)刺激24h，分别测定1型及2型组胺受体蛋白的表达结果.

　　1.2.4 统计学分析 用SPSS11.0软件包对数据进行统计学处理.

　　2 结果

　　当无刺激时,1型蛋白受体在变应性鼻炎组及慢性单纯性鼻炎组鼻黏膜组织中的表达间无明显差异(图1),2型蛋白在变应性鼻炎组鼻黏膜组织中的表达较慢性单纯性鼻炎组增多，但差异无统计学意义(图2).同时用TNFα，IL1β刺激24h后,1型蛋白在变应性鼻炎组鼻黏膜组织中的表达较慢性单纯性鼻炎组低，但差异无统计学意义(图3)，2型蛋白受体在变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组鼻黏膜组织中仅有微弱表达(图4).

　　3 讨论

　　组胺由肥大细胞及嗜酸性粒细胞分泌，参与各种过敏反应.Jordana等[4]认为，组胺可促进体外培养的成纤维细胞的增殖，而这种作用是通过2型组胺受体完成的.Johnson等[5]认为，鼻黏膜成纤维细胞中存在组胺受体.Hamano等[6]在鼻黏膜切片组织实验中发现,变应性鼻炎鼻黏膜1型组胺受体mRNA的表达明显高于非变应性鼻炎，在体外培养实验中亦发现变应性鼻炎黏膜组织内1型组胺受体mRNA的表达明显高于非变应性鼻炎，但体外培养的鼻黏膜血管内皮中1型组胺受体mRNA的表达在变应性鼻炎组与非变应性鼻炎组间无显著性差异.另外，据报道鼻黏膜上皮细胞与血管内皮细胞中均无2型组胺受体mRNA的表达[6],提示在变应性鼻炎中起主要作用的是1型组胺受体.Hirata等[7]则认为，鼻黏膜切片组织中可见2型组胺受体的表达,且在变应性鼻炎黏膜组织中的表达量明显高于非变应性鼻炎，而2型组胺受体主要分布于下鼻甲黏膜上皮层的浆液细胞及黏液细胞中.本实验结果表明，在无刺激的情况下变应性鼻炎鼻黏膜成纤维细胞1型组胺受体蛋白表达与非变应性鼻炎比较无显著性差异,提示在无刺激的条件下变应性鼻炎鼻黏膜1型组胺受体蛋白可能不参与变应性鼻炎的病理生理过程.然而2型组胺受体蛋白在变应性鼻炎中比慢性单纯性鼻炎组表达程度略高，2型组胺受体蛋白的表达在变应性鼻炎稳定期起一定的作用，即2型组胺受体蛋白可减少变应性鼻炎的发作可能性.Krouwels等[8]认为，1型组胺受体具有免疫诱导或向上调节炎症反应的作用，而2型组胺受体则具有抑制免疫细胞或炎症细胞活性的功能.Kohka等[9]用组胺刺激PBMCs后生成细胞因子的研究中发现,组胺仅在适当浓度的条件下才具有促进或抑制产生各种细胞因子的作用.本研究选用相同质量浓度刺激物，所以还无法全面地把握变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎成纤维细胞的所有特性.本研究用Flow cytometry法观察了组胺受体蛋白的表达，但结果显示蛋白的表达量少，且变应性鼻炎组稍低于慢性单纯性鼻炎组表达量，但无显著性差异.

　　【参考文献】

　　[1] Elias JA, Reynolds MM.Interleukin1 and tumor necrosis factor synergistically stimulate lung fibroblast interleukin1α production[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1990，3:3.

　　[2] Kim SW, Cho JS, Park JK, et al..Effect of interleukin4 and histamine on the fibroblast in the nasal mucosa of allergic rhinitis and nonallergic rhinitis[J].Korean J Otolaryngol,1999，42:329.

　　[3] 中华医学会耳鼻咽喉科分会，中华耳鼻咽喉科杂志编辑委员会.变应性鼻炎诊断标准及疗效评定标准[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33：134.

　　[4] Jordana M, Befus AD, Newhouse MT, et al..Effect of histamine on proliferation or normal human adult lung fibroblast[J].Thorax，1988，43:552.

　　[5] Johnson CL, Johnson CG.Inhibition of human skin fibroblast proliferation by histamine and phorbol esters is mediated by protein kinase C[J].Cell Signal,1990，2:105.

　　[6] Hamano N, Terada N, Maesako K, et al..Expression of histamine receptors in nasal epithelial cellsthe effects of sex hormones[J].Int Atch Allergy Immunol,1998，115:220.

　　[7] Hirata N, Takeuchi K, Ukai K, et al..Expression and localization of histamine H2 receptor messenger RNA in human nasal mucosa[J].J Allergy Clin Immunol,1999，103:944.

　　[8] Krouwels F, Hol B, Bruinier B, et al..Histamine affects interleukin4, interleukin5, and interferongamma production by human T cell clones from airways and blood[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1998，18:721.

　　[9] Kohka H, Nishibori M, Wagaki H, et al..Histamine potent inducer of IL18 and IFNγ in human peripheral blood mononuclear cells[J].American Association of Immunologists，2000，164:6640.