基因芯片技术在非综合征性耳聋快速基因诊断中的应用研究

　　作者：王国建　戴朴　韩东一　李彩霞　张地　韩冰　康东洋　张昕 作者单位：解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科(北京　100853)

　　【摘要】 目的　应用耳聋基因芯片对非综合征性感音神经性耳聋患者进行分子病因学研究，评估其在快速耳聋基因诊断中的可行性。方法　采集158名来自北京第三聋哑学校的非综合征性耳聋学生的外周血，提取基因组DNA，用耳聋基因芯片检测四个国人中常见的耳聋相关基因中的9个热点突变，包括GJB2(35delG，176del16bp，235delC及299_300delAT)，GJB3(538C>T及547G>A)，SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)和线粒体DNA 12S rRNA(A1555G)。同时，应用酶切法或直接测序法分别对线粒体12S rRNA A1555G突变，以及GJB2、SLC26A4基因编码区序列进行检测，以验证基因芯片结果的准确性。结果　在158名耳聋患者中，基因芯片方法共检出67例携带致聋突变(42.41%)。其中，线粒体DNA12SrRNA A1555G突变5例(3.16%);GJB2基因突变39例(24.68%)，包括235delC纯合突变24例，235delC和299_300delAT复合杂合突变7例，235delC单杂合突变5例，299_300delAT单杂合突变2例，35delG单杂合突变1例;SLC26A4基因突变22例(13.92%)，包括IVS7-2A>G纯合突变5例，IVS7-2A>G和2168A>G复合杂合突变5例，IVS7-2A>G单杂合突变11例，2168A>G单杂合1例;另外还有1例患者检出299_300delAT和IVS7-2A>G双杂合突变。未检出GJB3基因突变。除两例纯合235delC被判读为杂合外，基因芯片的结果同酶切及测序方法结果一致，后者的阳性患者检出率为70例(44.3%)，与芯片检测结果相比无统计学差异(P = 0.250)。经探针优化后，上述两例误判的235delC样品的芯片检测结果均与测序方法一致，同时经测序证实的其他22例235delC纯合突变样品验证，基因芯片的结果均与测序结果一致。结论　针对国人常见耳聋相关基因热点突变设计的耳聋基因芯片对非综合征性重度和极重度耳聋患者的突变检出率高(42.41%)。与传统方法相比，它具有快速、高通量、高准确性、低成本等特点，能够满足临床耳聋基因检测的要求;且其操作简单，易于标准化，适于推广，显示出广阔的临床应用前景。

　　【关键词】 　耳聋，GJB2基因，SLC26A4基因，GJB3基因，线粒体DNA，突变，基因芯片

　　Application of DNA microarray in rapid genetic diagnosis of　non-syndromic hearing loss

　　WANG Guo-jian, DAI Pu, HAN Dong-yi, LI Cai-xia, ZHANG Di , HAN Bing , KANG Dong-yang , ZHANG Xin

　　Department of Otorhinolaryngology Head Neck Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing, China

　　Medical Systems Biology Research Center, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing, China

　　CapitalBio Corporation & National Engineering Research Center for Beijing Biochip Technology, Beijing, China

　　【Abstract】 Objectives　To investigate the feasibility of a DNA microarray, designed according to the genetic background of China, in rapid genetic diagnosis of non-syndromic sensorineural hearing loss (NSHL). Methods　One hundred and fifty-eight moderate to profound NSHL patients were included in this study. Their genomic DNA samples were extracted from peripheral blood, and detected with the DNA microarray which is able to perform mutation detection of 9 hot-spot mutations in four most common pathologic genes, including GJB2(35delG, 176del16bp, 235delC, 299_300delAT ), GJB3(538C>T, 547G>A), SLC26A4(IVS7-2A>G, 2168A>G) and mitochondrial 12S rRNA(A1555G)simultaneously. At the same time, the results were confirmed with the traditional methods of sequencing and restriction enzyme digestion. Results　Of 158 patients， 67 were found out to be carriers of at least one pathogenic gene mutation. Among them, 5 (3.16%) have A1555G mutations, 39 (24.68%) have GJB2 mutations(235delC homozygous mutation in 24 cases, 235delC and 299_300delAT compound heterozygous mutation in 7 cases, 235delC heterozygous mutation in 5 cases, 299_300delAT heterozygous mutation in 2 cases, 35delG heterozygous mutation in 1 case), 22(13.92%) have SLC26A4 gene mutations(IVS7-2 A>G homozygous mutation in 5 cases, IVS7-2 A>G and 2168A>G compound heterozygous mutation in 5 cases, IVS7-2 heterozygous mutation in 11 cases, 2168A>G heterozygous mutation in 1 case), and 299_300delAT and IVS7-2 A>G double heterozygous mutation was revealed in one additional patient. No one carries GJB3 mutation. Except that two homozygous 235delC mutation cases were misjudged to be heterozygous mutation, the detection results of patients with microarray are identical to those with traditional methods, of which the positive ratio is 44.3%(70 cases). After probe optimization, the detection results of that two previously misjudged homozygous 235delC mutation samples are consistent with the sequencing results. The new optimized probe was also validated by the other 22 homozygous 235delC patient samples. The microarray results were fully concordant with the sequencing results. Conclusion　Being different from those traditional methods, the genetic diagnostic kit of hereditary deafness based on DNA microarray appears to have some inherent advantages in genetic diagnosis of NSHL, such as low time and money consuming, high performance and accuracy, which make it fit to be used in clinic gene testing. In addition, its features of easy manipulation, standardization and popularization endue it perfect prospect in clinical application.

　　【key words】　Deafness;　GJB2;　SLC26A4;　GJB3;　Mitocondrial DNA;　Mutation;　DNA microarray

　　耳聋是一种严重影响生活质量和交流的常见疾病。它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素，或基因与环境两者共同作用而致[1]。50%的儿童期耳聋被认为与遗传因素有关[2]，而70%的遗传性耳聋表现为非综合征耳聋(即除耳聋外不伴有其他症状和体征)。迄今为止，与非综合征耳聋相关的25个常染色体隐性基因、21个常染色体显性基因、1个X连锁基因已被克隆(http://webh01.ua.ac.be/hhh/)(更新日期2008年2月7日)，而每个基因中又散在数目众多的耳聋突变位点，因而具有较高的基因和位点遗传异质性。最近，在国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明，相当一部分非综合征性耳聋仅由为数不多的几个基因突变引起[1]，如GJB2[3]、SLC26A4[4]，mtDNA 12s rRNA[5]及GJB3[6]等，这为我们大规模开展耳聋基因筛查及诊断提供了理论依据。

　　目前，传统基因诊断方法包括酶切，限制性片段长度多态性分析( restriction fragment length polymorphism, RFLP)，DHPLC，直接测序等，这些方法或者不能定性，或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是这些方法难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测。因此有必要建立一种高通量、高效率的基因突变检测方法，以实现临床快速检测或大规模人群筛查。而伴随基因组计划出现和发展的基因芯片技术，以其固有的高效平行检测特点，与耳聋基因高遗传异质性的特点相契合，是一种极具潜力的耳聋基因检测工具。

　　我们与博奥生物有限公司合作，在大规模全国聋病分子流行病学调查数据基础上，针对国人非综合征性耳聋的突变热点，将等位基因特异性引物延伸PCR与通用芯片相结合，合作开发了一款遗传性耳聋基因诊断芯片，并用其检测了158例非综合征性耳聋患者，对其在临床应用的可行性进行了初步研究。

　　1　对象和方法

　　1.1　研究对象　北京第三聋人学校的158名非综合征性耳聋学生，其中男92例，女66例，年龄7岁 ～ 24岁，平均年龄为15.3岁。根据纯音测听结果，158人均为感音神经性耳聋。155人为重度以上耳聋(70 dB以上)，3人为中度耳聋(41 ～ 70 dB)。发病年龄从出生到7岁;152例为语前聋，6例为语后聋。

　　1.2　DNA提取　用含枸橼酸钠抗凝剂的真空采血管采集受检者3 ml ～ 5 ml外周静脉血，应用小剂量全血基因组DNA提取试剂盒 (上海华舜生物工程有限公司) 提取DNA，用BECKMAN DU800紫外分光光度计进行定量和纯度检测。

　　1.3　基因芯片检测

　　1.3.1　检测原理　针对不同突变位点设计两种带有不同标签的上游探针和一个下游带Cy3荧光标记的公共引物，先在液相中进行多重等位基因特异性引物延伸PCR，PCR扩增产物在带上一段标签序列(tag sequence)的同时，被单色荧光所标记。将产物变性后，与固定有标签互补寡核苷酸序列的芯片杂交，通过激光扫描检测出突变位点[7]。

　　1.3.2　仪器及试剂　ABI 9700 PCR仪，恒温水浴箱(国产长风)，HZQ-C空气浴振荡器。本实验中所用的的荧光标记引物，以及晶芯 LuxScanTM 10K/B微阵列芯片扫描仪及相应软件系统、质控探针和DNA芯片、杂交盒及杂交试剂由博奥生物有限公司提供。

　　1.3.3　PCR反应　将针对11个突变位点的11组引物分成7Mix和4Mix两个反应体系分别进行多重PCR，在每个15 ?滋l反应体系中加入100 ng模板DNA， 10× hotstar buffer， 2.5 mmol/L dNTP， 　　　25 mmol/L MgCl2，引物Mix，5U/?滋l hotstar酶以及ddH2O。PCR程序：95℃ 15min，96℃ 1min预变性，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s共32 个循环，70℃ 45 min，60℃ 10 min。在扩增过程中，参数设置使温度以0.5°C/s的速度从94°C降温至55°C;以0.2°C/s的速度从55°C升温至70°C。

　　1.3.4　杂交　将PCR产物加热至95℃ 变性5 min，立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。从两个不同的扩增体系管中各取2.5 μl PCR产物加入到10 μl杂交缓冲液管中。将混合液加到芯片的点样区域，加盖玻片，封闭杂交盒，然后放入50℃预热杂交箱中保温1 h。

　　1.3.5　洗片　取出芯片，在42℃ 洗涤液Ⅰ中以摇床洗涤2 min，迅速取出放入已经预热好的另外一杯42℃ 洗涤液Ⅱ中，摇床洗涤2 min。将芯片或玻片架放入适当的容器，置入离心机中以1200 rpm离心2 min甩干。

　　1.3.6　扫描　晶芯　LuxScanTM 10K/B微阵列芯片扫描仪以90的激光扫描强度和532 nm激发波长进行芯片扫描。

　　1.3.7　结果判定　若在同个位点中A列检测数据为阳性，同时B列也为阳性，判读结果为该位点突变杂合型;若在同个位点中A列检测的数据为阳性，同时B列为阴性，判读结果为该位点野生型;若在同个位点中A列检测的数据为阴性，同时B列为阳性，判读结果为该位点突变纯合型;若在不同位点中出现上述情况的组合，则判读结果为多位点复合突变(图1)。

　　1.4　GJB2编码区序列及SLC26A4基因序列检测 　　采用戴朴报道的方法[8]进行引物设计、PCR扩增及直接测序。其中对于SLC26A4基因，采用以下筛查策略：先筛查突变热点区域第7 + 8、第19外显子;如发现纯合或复合杂合突变即停止筛查，如发现单杂合突变则先筛查第10、17、15、3外显子，然后筛查剩余外显子，直至发现另一个突变或筛查完全部外显子。

　　1.5　线粒体DNA 12SrDNA A1555G点突变检测 应用Prev-DAF药物性耳聋基因诊断试剂盒检测[9]。

　　2　结果

　　2.1　应用基因芯片方法在158例NSHL患者中检出的阳性率为42.41%，应用传统的酶切/测序方法的检出阳性率为44.30%(表1)。部分检测结果见图2。

　　2.2　两种方法对GJB2突变等位基因检出情况

　　对于芯片点阵所包括的GJB2基因突变位点(235delC、299_300delAT、35delG、176del16)，通过基因芯片法分别检出等位基因突变58个、10个、1个及0个，而用测序方法分别检出60个、10个、1个、0个。对于前三者的等位基因突变检出率，基因芯片法与测序方法的符合率分别为96.7%(58/60)、100%(10/10)和100%(1/1)。

　　对于235delC位点，由于在芯片结果中将235delC纯合突变肉眼误判为单杂合突变，使两种方法符合率为96.7%(图3)。

　　2.3　两种方法对SLC26A4等位基因突变检出情况

　　对于芯片点阵所包括的SLC26A4基因突变位点(IVS7-2A>G、2168A>G)，通过基因芯片法分别检出等位基因突变27个和6个，而用测序方法分别检出27个和6个。对于两者的等位基因突变检出率，基因芯片法与测序方法的符合率均分别为100%(27/27;6/6)。

　　2.4　统计分析

　　除两例纯合235delC被判读为杂合外，应用基因芯片检测的结果同酶切及测序方法的结果一致，后者的阳性突变检出率为44.3%(70例)。经配对卡方检验(McNemar检验)，两种方法在阳性病人检出率间无统计学差异(P = 0.250)。

　　3　讨论

　　基因芯片技术是随着基因组计划发展起来的生物技术，其基本原理是核酸杂交，即采用原位合成或合成后点样的方法将许多特定的DNA探针有规律地固化于支持物表面，产生二维DNA探针阵列，将样品DNA或RNA通过PCR扩增并进行荧光标记，然后与芯片探针进行杂交，再用激光或CCD摄影头扫描仪扫描杂交信号，通过目测或软件分析得到基因表达或突变的信息。基因芯片技术的出现和快速发展为高通量的SNP(单核苷酸多态性)和基因突变检测带来新的曙光。

　　耳聋具有较高的遗传异质性。众多的耳聋相关基因及位点不断被发现，但传统的检测方法无法解决同时检测多突变位点的问题，而基因芯片能够提供高效的平行检测平台。目前，国外已有报道将一些较高通量的基因芯片运用到耳聋基因突变和多态性的检测中[10， 11]，但是因所需设备及芯片造价昂贵或设计复杂，限制了大规模的耳聋基因筛查及临床诊断的开展。而且，由于耳聋基因的遗传及种族异质性，国外的芯片不能照搬，因此迫切需要开发一款适合中国国情及遗传学背景，且准确、简便、经济的耳聋基因检测芯片。

　　一般认为，遗传性耳聋占儿童期耳聋的50%，其具有较高的遗传异质性。GJB2基因和SLC26A4基因是非综合征性常染色体隐性遗传性耳聋中最常见的两个致病基因[12]。近年来国内大规模聋病分子流行病学研究也显示，这两种基因突变在非综合征型耳聋病因中共占30%以上[4, 13]。两者具有一些共同特点：都会引起重度和极重度感音神经性聋，都有突变热点，且其突变热点存在着显著的种族差异。对GJB2基因来说，高加索人热点突变为35delG，犹太人热点突变为167delT，而中国人的热点突变为233-235delC[14]，其次为299_300delAT及176del16bp等。SLC26A4基因与大前庭水管综合征及Pendred综合征的关系密切，在欧洲患者中，T416P 和L236P是其最常见的两种突变类 型[15];而在中国，突变频率最高的类型为IVS7-2A>G和H723R[4, 16]。对于线粒体12S rRNA A1555G突变，其携带率为3.4%[5]，因其致病机制明确，而且检出一例患者，即可对约10名携带该突变但未发病的母系成员进行很好的预警效果，因此也是一线筛查的候选基因。另外，在中国克隆的第一个耳聋基因GJB3中的E183K和R180X突变位点被认为与高频听力下降有关[6]。这些分子流行病学信息对基因芯片的构建具有重要的指导 意义。

　　我们将四个常见的耳聋相关基因中的9个国人热点突变—— GJB2(35delG，176del16bp，235delC及299_300delAT)，GJB3(538C> T及547G > A)，SLC26A4(IVS7-2A > G、2168A > G)和线粒体 DNA12S rRNA(1555A> G)，以及两个高加索人和犹太人频发的耳聋位点 —— GJB2 167delT和SLC26A4的707T > C设计在芯片位点中，以期用较少的探针即可达到较高的检测效能。通过传统方法的验证，我们对该芯片的特点分析和总结如下：

　　(1)检出率高：芯片点阵对重度以上耳聋患者的检出阳性率较高，通过基因芯片，我们可以发现42.41%的阳性携带者，其中能够确诊的病人达29.11%(46/158)，筛出的阳性率与传统方法相比没有统计学差别。尽管在复合杂合的检出率有所降低，但只查到单杂合突变的病人也提示其有较大可能性为遗传性耳聋并建议进行进一步的耳聋基因筛查。在本研究中，未发现167delT和707T>C突变，这与文献报道的两者为欧美突变热点的结论相吻合，间接验证了耳聋的种族异质性。

　　(2)通量高：基因芯片方法可以在5个小时内走完PCR反应到扫描全过程，完成11个位点的检测。而要用传统方法进行这些位点的检测，即便同时进行的话，至少需5个PCR反应，10个小时完成。每张芯片可同时检测四个个体，每次可同时检测多张芯片。这些都充分体现了芯片技术高通量的优势，其检测速度可以满足临床要求。

　　(3)准确性高：通过对芯片和传统方法结果相比较，芯片的准确率几乎达到100%，这归因于液相酶促反应的高特异性。在本研究中，仅在区别235delC的纯合或杂合突变时出现误判(图3)，分析其原因可能为带荧光PCR产物与芯片标签(Tag)探针的非特异性杂交造成噪声信号增强而被肉眼误判为阳性，可更换此点阵的 Tag序列，降低碱基错配的几率。经探针优化后，上述两例误判的235delC样品的芯片检测结果均与测序方法一致，同时经测序证实的其他22例235delC纯合突变样品验证，基因芯片的结果均与测序结果一致(图3)。另外，将大批量样本芯片检测结果的野生型和突变型点阵的平均荧光信号值进行统计分析，设定区分两者的CUT-OFF值，应用判读软件进行自动判读，可减少肉眼判读的误差。

　　(4)判读方便：对芯片结果的判读直观，快捷。如配合判读软件则将进一步增加其准确性。

　　(5)设备要求不高：在临床检测过程中，除芯片外，仅需PCR仪、恒温摇床、水浴箱、激光扫描仪等，其试剂价格相对低廉，因此这种耳聋基因芯片检测系统的成本不高。

　　虽然目前仅能够检测国人9个基因突变热点，但后者在遗传性耳聋病因中所占比例高，因而通过此款芯片能在重度以上的非综合征性耳聋患者得到较高的阳性检出率(42.41%);另外，由于此芯片平台可通过不断增加芯片Tag探针来增加芯片检测的位点数目，从而覆盖更多的遗传性耳聋突变热点，因此具有很高的灵活性。但在增加检测位点时，如何保持多重PCR的稳定性是以后开发芯片时要考虑的问题。

　　与高通量基因芯片相比较，这款专为国人遗传性耳聋设计的小型芯片，可以达到快速、敏感、准确诊断的目的;且其操作简单, 易于标准化，适于推广，因而显示出广阔的临床应用前景。

　　【参考文献】

　　1　刘学忠, 欧阳小梅, Yan D, et al. 中国人群遗传性耳聋研究进展. 中华耳科学杂志, 2006, 4(2): 81-89.

　　2　Morton NE, Genetic epidemiology of hearing impairment. Ann N Y Acad Sci, 1991, 630: 16-31.

　　3　于飞， 戴朴， 韩东一. GJB2基因突变及语前遗传性非综合征性耳聋. 国外医学耳鼻咽喉科学分册, 2005. 29(6): 359-361.

　　4　戴朴， 朱秀辉， 袁永一， 等. Pendred综合征基因热点突变筛查赤峰市聋哑学校大前庭水管综合征患者. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2006, 41(7): 497-500.

　　5　刘新， 戴朴， 黄德亮， 等. 线粒体DNAA1555G突变大规模筛查及其预防意义探讨. 中华医学杂志, 2006, 86(19): 1318-1322.

　　6　Xia JH, Liu CY, Tang BS, et al. Mutations in the gene encoding gap junction protein beta-3 associated with autosomal dominant hearing impairment. Nat Genet, 1998, 20(4): 370-373.

　　7　Li CX, Pan Q, Guo YG, et al. Construction of a multiplex allele-specific PCR-based universal array (ASPUA) and its application to hearing loss screening. Hum Mutat, 2008, 29(2): 306-314.

　　8　戴朴，于飞，康东洋，等. 线粒体DNA1555位点和GJB2基因及SLC26A4基因的诊断方法及临床应用. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2005, 40(10): 769-773.

　　9　戴朴，杨伟炎， 韩东一， 等. Prev-DAF试剂盒分析线粒体基因1555A-G突变. 中华耳科学杂志, 2004, 2(1): 37-41.

　　10　Gardner P, Oitmaa E, Messner A, et al. Simultaneous multigene mutation detection in patients with sensorineural hearing loss through a novel diagnostic microarray: a new approach for newborn screening follow-up. Pediatrics, 2006, 118(3): 985-994.

　　11　Siemering K, Manji SS, Hutchison WM, et al. Detection of mutations in genes associated with hearing loss using a microarray-based approach. J Mol Diagn, 2006, 8(4): 483-489; quiz 528.

　　12　Kelley PM, Harris DJ, Comer BC, et al. Novel mutations in the connexin 26 gene(GJB2) that cause autosomal recessive (DFNB1) hearing loss. Am J Hum Genet, 1998, 62(4): 792-799.

　　13　于飞， 戴朴，曹菊阳， 等. 中国东北地区非综合征性耳聋患者GJB2基因的致聋突变分析. 中国实验诊断学, 2006, 10(1): 38-41.

　　14　Dai P, Yu F, Han B, et al. The prevalence of the 235delC GJB2 mutation in a Chinese deaf population. Genet Med, 2007, 9(5): 283-289.

　　15　Campbell C, Cucci RA, Prasad S, et al. Pendred syndrome, DFNB4, and PDS/SLC26A4 identification of eight novel mutations and possible genotype-phenotype correlations. Hum Mutat, 2001, 17(5): 403-411.