病毒与非病毒载体转染新生大鼠血管纹边缘细胞的比较研究

　　作者：杨阳　孔维佳　李隽　胡钰娟　钟毅　郝亚楠　赵学艳　彭炜 作者单位：中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉-头颈外科(武汉　430022)

　　【摘要】 目的　通过病毒与非病毒载体对原代培养的新生大鼠内耳血管纹边缘细胞转染情况的比较，选择出适合边缘细胞的基因治疗载体。方法　用质粒(pEGFP-N1)、血清5 型重组腺病毒(rAd5)以及血清2 型重组腺相关病毒(rAAV2)三种载体转染新生大鼠(≤ 72小时)耳边缘细胞，通过对转染效率、细胞凋亡以及细胞活性的检测将三种载体加以比较。结果　对边缘细胞的转导效率依次为rAd5 > rAAV2 > pEGFP-N1，AnnexinⅤ- APC/7-AAD双染法检测转染阳性细胞的损伤情况依次为rAAV2 < rAd5 < pEGFP-N1，CCK-8法检测转染后的细胞活性依次为rAAV2 > rAd5 > pEGFP-N1。结论　病毒载体相对于非病毒载体以其高转导效率、低细胞毒性在对原代培养的新生大鼠耳边缘细胞的转染中表现出明显优势。与血清2 型重组腺相关病毒比较，相对高效、低毒性的血清5 型重组腺病毒更适用于原代培养的新生大鼠血管纹边缘细胞的基因转染研究。

　　【关键词】 质粒pEGFP-N1，耳边缘细胞

　　Comparison of gene transfer into newborn rat cochlear marginal cells in primary culture using different vectors

　　Yang Yang, Kong Wei-jia, Li Jun, Hu Yu-Juan, Zhong Yi, Hao Ya-nan, Zhao Xue-yan, Peng Wei

　　Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Union Hospital of Tongji Medical College, Hua

　　Zhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

　　【Abstract】 Objective　Plasmids, recombinant adenoviruses(rAds), and adeno-associated viruses(rAAVs) are frequently used vectors, each with distinctive characteristics that may be advantageous in cochlea gene therapy. Although the general advantages and disadvantages of these vectors had been evaluated, there were no data available on the delivery of extrogene to marginal cells(MCs) of the stria vascularis(SV) in primary culture using nonviral and viral vectors. Methods　In this study, the rat cochlear SV MCs were transfected with plasmid vector-pEGFPN1, rAd5, and rAAV2. The transfection efficiency, the incidence of cellular apoptosis and cell's activity were evaluated after transfection. Results　The transfection rates were as follows: pEGFP-N1, 23.65-45%; rAAV2, 46.89-88%; and rAd5, 78.89-99%. The MCs viabilities after transfection were as follows: PEGFP-N1, 75.79-85.93% (average 80.7%); rAAV2, 97.54-99.76%(average 98.32%); rAd5, 88.62-93.3%(average 91.00%); and normal control, 98.93-99.89%(average 99.27%). The proportions of early apoptotic cells, end- stage apoptotic and dead cells were as follows: pEGFPN-1-transfected MCs, 39.8%; rAAV2-transfected MCs, 2.4%; and rAd5-transfected MCs, 9.2%. Conclusion　Our results indicated that viral vectors were more reliable and efficient vehicles for gene transfer to the SV MCs of cochlea compared to plasmid vector. Given its high transfection efficiency and low cytotoxicity, rAd5 was more suitable for transfection of SV MCs in vitro.

　　【Key words】　 pEGFP-N1;　Adenovirus 5(Ad5);　Adeno-associated virus 2(AAV2);　Transfect;　Marginal cell (MC);　Rat

　　内耳中阶外侧壁的血管纹(stria vascularis，SV)是内、外淋巴屏障结构的一部分，在维持内耳内环境稳定中发挥着重要作用。血管纹主要由三种细胞类型组成：边缘细胞(marginal cell，MC)，基底细胞(basal cell)和中间细胞(intermediate cell)[1]。其中边缘细胞从血管纹内间隙吸收K + 并将其从顶膜分泌对维持耳蜗内电位、提供机械-电换能时的载流体具有重要意义[2]。先前研究主要通过膜片钳技术及分子生物学技术来探讨血管纹边缘细胞的功能学特征，基因工程技术为进一步研究边缘细胞的功能提供了有效的手段。目前国际上尚无将转基因技术应用于边缘细胞功能学研究的报道。有效地目的基因转导及表达是决定基因治疗成功与否的关键，这在很大程度上取决于基因转导载体的选择。

　　本研究通过探讨病毒与非病毒载体转染原代培养的新生大鼠耳血管纹边缘细胞的比较研究，以筛选出适合边缘细胞的基因治疗载体，为基因技术在边缘细胞中的应用研究提供指导。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　巨细胞病毒启动子启动的携带增强型绿色荧光蛋白的血清5型重组腺病毒(rAd5-EGFP)以及血清2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)购自北京本元正阳基因技术有限公司，巨细胞病毒启动子启动的携带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体(pEGFP-N1)和大肠杆菌DH5?琢菌株购自Clontech，去内毒素质粒提取试剂盒购自Omega，LipofectamineTM2000(脂质转染胺)和OPTI-MEMⅠReduced Serum Medium购自Invitrogen，LB培养基购自Qbiogene，DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco，0.25%胰蛋白酶购自Sigma，Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所，AnnexinⅤ(膜联蛋白V)-APC和7-AAD(7-Amino-Actinomycin D，7-氨基放线菌素D)购自Bender Med- Systems。6通道流式细胞检测仪(Becton Dickinson)，光学解剖显微镜和LX70型荧光倒置显微镜(Olympus)，M450酶标仪(Biotech Instuments)，恒温振荡培养摇床(苏净集团安泰公司)。新生Wistar大鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。

　　1.2　方法

　　1.2.1　血管纹边缘细胞的原代培养

　　培养方法参考文献[3]。

　　1.2.2　脂质体介导的边缘细胞转染

　　1.2.2.1　质粒DNA提取

　　转化菌扩增参考文献[4]。质粒DNA提取按照Omega公司的去内毒素质粒提取试剂盒说明书进行。

　　1.2.2.2　转染

　　转染按照LipofectamineTM 2000试剂盒说明书进行。

　　1.2.3　病毒介导的边缘细胞感染: (1)转染前一天将细胞种于24孔板中，使转染当天贴壁面积达80%左右;(2)将rAd5-EGFP病毒液(3 ?滋l，6 × 109 TCID50)或rAAV2-EGFP病毒液(6 ?滋l，5 ×　1011 v.g/ml)分别与150 ?滋l OPTI-MEM培养基混合，加入细胞培养盘中。

　　1.2.4　转染效率检测

　　1.2.4.1　形态学观察

　　荧光倒置显微镜观察转染后24小时、72小时、7天和10天边缘细胞细胞表达报告基因EGFP的情况。

　　1.2.4.2　转染效率检测：(1)转染后72小时和第10天，0.25%胰酶消化细胞，1 000 r/min，10 min，弃上清。(2)0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS)200 ?滋l重悬细胞。(3)流式细胞仪(FL1通道)检测转染效率。

　　1.2.5　转染后的边缘细胞活性检测

　　1.2.5.1　原理

　　CCK-8利用四唑盐 — WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]在电子载体1-Methoxy PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯)存在的情况下能够被细胞内脱氢酶还原成水溶性的橙色甲月朁 染料，其生成的甲月朁 量与活细胞的数量成正比。

　　1.2.5.2　方法

　　(1)转染前一天将细胞种于96孔板中，使转染当天贴壁面积达80% 左右，转染方法同前;(2)分设空白对照组、质粒DNA(pEGFP-N1)转染组、rAAV2-EGFP感染组和rAd5-EGFP感染组，每组5孔;(3)第72小时和10天，分别用100 ?滋l无血清培养基定容，每孔加CCK-8溶液10 ?滋l，放入37℃ 5%CO2及饱和湿度培养箱中继续孵育4小时;(4)酶标仪(波长 450 nm)测定吸光度(A)值。根据A值计算出细胞活力。细胞活力(%) =(实验组细胞数/对照组细胞数)× 100%。

　　1.2.6　转染后的边缘细胞损伤情况检测

　　1.2.6.1　原理

　　在凋亡早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)从细胞膜内层暴露于外层 ,从而可被PS特异的Annexin V探针所标记。由于7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin V结合7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin V，晚期凋亡细胞或坏死细胞可被标记上7-AAD。

　　1.2.6.2　方法

　　(1)转染方法同前;(2)0.25% 胰酶消化细胞，1 000 r/min，10 min;(3)将AnnexinⅤ-APC 5 ?滋l和7-AAD 10 ?滋l 加入Binding Bufffer 50 ?滋l中，用此溶液重悬细胞;(4)孵育30分钟后流式细胞仪检测(FL4 通道测Annexin Ⅴ-APC，FL3 通道测7-AAD)。

　　2　结　果

　　2.1　新生大鼠内耳血管纹边缘细胞的原代培养

　　组织块贴壁的第二天，MCs从组织块周边呈辐射状迁移出来(图1a);培养的第4 ～ 5天，MCs即呈现多角形外观，核大而圆、颜色较暗淡，细胞之间连接紧密呈“铺路石样”样(图1b)。

　　2.2　转染效率检测

　　rAd5-EGFP感染的MCs中 24小时后即可见大量报告基因EGFP的表达(图2 B1)，第72小时时流式细胞仪检测转染效率近100%(图3 C2)，在10天时转染效率仍有80%左右(图2 B4，图3 C1)。转染后48 ～ 72小时，脂质体介导的pEGFP-N1(图2 A2)和rAAV2-EGFP(图2 C2)转染的MCs中报告基因EGFP的表达明显增多，此后逐渐下降，rAAV2-EGFP在第10天的转染效率为50%左右(图2 C4， 图3 B1)，pEGFP-N1在第10天表达量较前明显减少(图2 A4，图3 A1)。

　　2.3　不同载体转染后边缘细胞的活性

　　根据公式:细胞活性(%)=(实验组细胞数/对照组细胞数)× 100%。在转染的第72小时和第10天，不同载体转染后的MCs活性如下(图4)：空白对照组，98.93% ～ 99.89%(平均99.27%);pEGFP-N1，75.79% ～ 85.93%(平均80.70%); rAAV2-EGFP，97.54% ～ 99.76%(平均98.32%);rAd5-EGFP，88.62%　～　93.3%(平均91.00%)。

　　2.4　不同载体转染后边缘细胞的损伤情况检测

　　AnnexinⅤ-APC和7-AAD双染检测转染后的MCs损伤情况(图5)。流式图上可看到三群细胞，早期凋亡细胞分布在右下象限，晚期凋亡和坏死细胞分布在右上象限和左上象限，正常活性细胞分布在左下象限。脂质体介导的pEGFPN-1转染阳性MCs的早期凋亡率为14%，晚期凋亡率 + 坏死率为25.8%(图5B)。rAAV2-EGFP转染后的MCs早期凋亡率为1.1%，晚期凋亡率+坏死率为1.3%(图5C)。rAd5-EGFP转染后的MCs早期凋亡率为4.0%，晚期凋亡率 + 坏死率为5.2%(图5D)。空白对照组的MCs早期凋亡率为1.1%，晚期凋亡率 + 坏死率为1.0%(图5A)。

　　3　讨　论

　　在人类基因组计划的推动下，基因技术已成为极有希望的治疗策略，在耳聋康复方面，基因技术也是一种很有前景的实验和临床治疗手段。基因治疗早已用于包括肿瘤[5]、心血管疾病[6]及中枢神经系统疾病[7]等的治疗研究，但其在耳科学的研究起步较晚。

　　在内耳内、外淋巴间隙周边有许多重要结构，其中血管纹在维持内耳正常功能中发挥着重要作用。血管纹主要由三种细胞类型组成：边缘细胞(marginal cell)，为上皮源性，被覆在蜗管的管腔外壁;基底细胞(basal cell)，为中胚层源性或起源于神经嵴，也形成一连续层面;中间细胞(intermediate cells)，为黑素细胞样细胞，可能起源于神经嵴，散布于边缘细胞和基底细胞层之间[1]。血管纹边缘细胞对维持耳蜗内电位、提供机械-电换能时的载流体具有重要意义[2]。先前研究主要采用膜片钳技术及分子生物学技术来探讨血管纹边缘细胞的特性，到目前为止尚缺乏对边缘细胞基因转染方面的研究。

　　基因治疗研究的快速发展对基因导入系统提出了越来越高的要求。有效的靶基因转导和转基因表达是决定临床基因治疗成功与否的关键，这在很大程度上取决于基因治疗载体的选择。基因治疗载体可分为病毒载体和非病毒载体两类。非病毒载体以质粒载体为代表;病毒载体中的腺病毒、腺相关病毒是目前应用最广的基因治疗载体。质粒(plasmid)载体是非病毒载体的核心，其优点是最大插入片段可达10 kb(kb表示千碱基对)，相对于病毒载体，其转染过程需要阳离子型脂质体的辅助，质粒DNA存在靶向困难、转染效率低、表达时间短等缺点[8]。腺病毒(adenovirus，Ad)载体因具有靶细胞种类多，导入效率高，携带的目的基因表达迅速等优点，在基因治疗研究领域备受重视[9]。但腺病毒也有其局限性，其携带的目的基因表达时间短，腺病毒骨架蛋白可引发宿主机体强烈的

　　免疫反应，从而产生不良影响。腺病毒相关病毒　(adeno-associated virus，AAV)是4.7 kb的单链DNA基因组人类微小病毒，被认为是最安全的病毒载体，目前已发现的AAV有11种血清型，研究最成熟的是血清2型-AAV2[10]。AAV是一种人源性病毒，具有免疫反应轻微，无随机整合致癌之危险，安全性好，以及介导的外源基因可持续稳定表达等优点[11]。不同血清型AAV载体对不同组织的亲合力不同，其在小鼠肝脏和肌肉组织中感染效率由高到低的顺序是1 > 5 > 3 > 2 > 4，在大鼠视网膜中的感染效率顺序是5 > 4 > 1 > 2 > 3[12]。本实验从转染效率和对体外原代培养的细胞活性影响方面对pEGFP-N1、rAd5和rAAV2三种载体加以比较，以期筛选出更适合于耳蜗血管纹边缘细胞基因转染研究的载体系统。

　　原代培养的新生大鼠内耳血管纹边缘细胞在不传代的情况下，较佳生活状态最多可维持10天左右[3]，由于转染后的细胞比较脆弱，胰酶消化后细胞难以贴壁，原有的生长状态被破坏，所以本实验的观察期限为10天。我们对MCs转染的实验研究发现血清5型重组腺病毒转染效率最高，血清2型重组腺相关病毒次之，质粒pEGFP-N1的转染效率最低。细胞转染中，腺相关病毒在转染效率上并不比腺病毒更具有优势，这在Chu 等的研究中也有提到[13]。不同病毒载体转染效率的差异是由其特异受体的差别决定的。腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体，这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体即CAR(coxsackie/adenovirus receptor)，其广泛分布于多种哺乳动物组织细胞表面[14]。腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的，病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合，通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中，最后完成腺病毒颗粒的核转位[15]。血清2型重组腺相关病毒主要选择性地感染表面有硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)受 体的细胞[16]，αvβ5整合素和碱性成纤维细胞生 长因子1(basic fibroblast growth factor receptor 1，bFGFR1)作为共受体也参与AAV2的感染过程，bFGFR1被认为可增强AAV2对宿主细胞的黏附过程，而αvβ5整合素则在AAV2的细胞内吞过程中扮演重要角色[17]。质粒载体的转染过程是经膜样物质脂质体包裹后通过胞吞作用进入细胞的[18]。由我们的实验结果可以推断，原代培养的胎鼠内耳血管纹边缘细胞表面，柯萨奇/腺病毒受体的表达高于硫酸肝素蛋白聚糖受体，而且再次证实了通过受体介导的基因转染效率远高于通过胞吞作用介导的基因转染效率[18]。

　　我们的研究发现，质粒转染方式对细胞活性影响最大，腺病毒和腺相关病毒转染对细胞活性的影响较小，尤其是腺相关病毒的感染对MCs的活性影响最小。质粒转染方式的高毒性可能是由于在外源基因通过胞吞作用进入细胞的过程中，引发了细胞膜性状的改变，使其脆弱受损;或引发了异常的离子流，从而增加了被转染细胞的死亡概率[9]。腺病毒对细胞生长的干扰可能是由于其过高的外源基因导入效率和载体本身基因组较大，在一定程度上干扰了宿主细胞基因组的稳定性，而诱发了一部分宿主细胞的异常凋亡(坏死)。腺相关病毒转染效率适中，且其本身基因组只有4.7 kb，对宿主细胞基因组的干扰小，最大程度上维持了宿主细胞的正常生活状态。

　　综上所述，病毒与非病毒载体均可介导外源基因在原代培养的新生大鼠内耳血管纹边缘细胞的表达，但在转染效率(目的基因的表达量)和维持细胞活性方面，病毒载体都表现出明显的优势。与腺相关病毒比较，相对高效、低毒性的腺病毒更适用于原代培养的新生大鼠内耳血管纹边缘细胞的基因转染研究。

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