凯西莱联合青霉胺治疗肝豆状核变性模型鼠的研究

凯西莱联合青霉胺治疗肝豆状核变性模型鼠的研究作者：徐磊,蔡永亮,徐志树,陈怀珍,王艳昕,徐国存    作者单位：230031合肥，安徽中医学院第一附属医院神经内科    【摘要】  目的 探讨凯西莱（MPO）联合青霉胺（PCA）对肝豆状核变性（HLD）模型鼠铜代谢及肝功能的影响。方法 采用铜负荷饮食法喂养大鼠制作HLD模型，并分为HLD对照组、MPO组、PCA组及MPO+PCA组，予以相应的药物干预。观察各组大鼠肝铜、24 h尿铜及谷氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）水平变化情况。结果 HLD对照组、各药物干预组肝铜、24 h尿铜水平较正常对照组显著增高（均P<0.01）；MPO+PCA组、PCA组肝铜水平较HLD对照组、MPO组显著降低（均P<0.01），24 h尿铜各药物干预组较HLD对照组显著增高（P<0.05～0.01）。ALB水平各药物干预组较HLD对照组显著增高（P<0.05～0.01），各药物干预组间差异无统计学意义。MPO+PCA组ALT、AST水平较HLD对照组、PCA组、MPO组显著降低（均P<0.05），与正常对照组相比差异无统计学意义。结论 MPO联合PCA能显著降低HLD模型鼠肝铜水平，促进尿铜排泄，升高血清ALB水平，保护肝功能，效果优于PCA或MPO单用。    【关键词】  肝豆状核变性;凯西莱;青霉胺;铜负荷饮食    Study of  Tiopronin combine Penicillamine to treated in rat model with hepatolenticular degeneration   XU Lei， CAI Yongliang， XU Zhishu, et al.Department of Neurology,the First Hospital Affiliated to Anhui Traditional Chinese Medical College, Heifei 230031,China    Abstract：Objective  To study the effects of Tiopronin(MPO)combine Penicillamine(PCA) on the copper metabolism and function of liver in  rats model with hepatolenticular degeneration. Methods  To copy hepatolenticular degeneration model rats with copper overloaded diet.Divide the models into  groups HLD control,MPO,PCA  and MPO+PCA, and interfere with the propotional drugs. To investigate the concentration changes of the lalanine aminotransferase (ALT), spartate amino transferase(AST), total protein(TP), albumin(ALB), liver copper and 24 h urine copper  in each group.Results  The concentrations of  liver copper and 24 h urine copper  in HLD control group and each group with drugs intervention were significantly higher than those in normal control group(all P<0.01),the concentrations of liver copper in groups MPO+PCA  and PCA were significantly lower than those in groups HLD control  and MPO (all P<0.01), the concentrations of the 24 h urine copper  in each group with drugs intervention were significantly higher than that in HLD control group(P<0.05～0.01).The concentrations of ALB in each group with drug intervention were significantly higher than that in  HLD control group(P<0.05～0.01),but no significant change among them. The concentrations of ALT、AST in MPO+PCA group were significantly lower than those in groups HLD control ,PCA and MPO (allP<0.05),and no significantly  diffenrent compared with  normal control group.Conclusions  The effects of MPO combine PCA can reduce the concentrations of  liver copper in  HLD rats, and promote the excretion of the 24 h urine copper,increases serum ALB level, protect the function of liver, it is better than use the MPO or PCA individually.    Key words： hepatolenticular degeneration; Tiopronin; Penicillamine; copper overloaded diet    凯西莱又名硫普罗宁（MPO)，是一种新型的含巯基甘氨酸类药物，其化学名为N(2巯基丙酰基)甘氨酸，除具有改善肝功能的作用外，还具有络合重金属的作用。为此，本实验利用MPO联合青霉胺（PCA）治疗肝豆状核变性（HLD）模型鼠，观察其对HLD大鼠的铜代谢和肝功能的影响。1  材料与方法    1．1  材料    1．1.1  动物及分组  纯系健康雄性Wistar大鼠60只，质量220～280 g，购于安徽医学科学研究所实验动物中心。实验前先适应性饲养1周，随机分为正常对照组（10只）及HLD组（50只），HLD组再随机分为HLD对照组、MPO组、PCA组和MPO+PCA组。    1.1.2  主要试剂与仪器  MPO（新谊药业股份有限公司）；PCA、谷氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；WFX1A型原子吸收分光光度计（北京）；721型分光光度计（上海第三分析仪器厂）。    1.2  方法    1.2.1  动物模型制作及药物干预  将HLD组大鼠喂饲铜负荷饮食（含硫酸铜1 g/kg的粉状饲料和0.185%硫酸铜的去离子水）8周；第5周开始，将存活的42只模型大鼠随机分为4组，HLD对照组：12只；PCA组：10只， 予以PCA 100 mg/kg每日1次灌胃；MPO组：10只， 予以MPO 100 mg/kg每日1次灌胃；MPO+PCA组：10只， 予以MPO 100 mg/kg+PCA 100 mg/kg每日1次灌胃；均为4周。正常对照组喂饲普通饲料8周。    1.2.2  标本采集及检测  铜负荷饮食8周结束后禁食18 h并麻醉动物，从眼内眦取血2 ml置于抗凝管，全自动生化仪检测血ALT、AST、TP、ALB，测定按试剂盒说明书操作。剖腹取肝组织，标本先用0.9%NaCl反复洗净，干净滤纸吸干并秤取湿重500 mg，用浓硝酸(分析纯) 10 ml低温加热进行消化，等组织完全溶解至黄色澄清透明后，采用原子吸收分光光度计测量、火焰法测定Cu+3含量。24 h尿Cu+3测定：处死前5 d单只置于代谢笼连续留取3 d（72 h尿液），摇匀后准确量出尿液体积，测定时取2 ml尿液加0.1 ml H2SO4混匀待测，采用原子吸收分光光度计测量、火焰法测定。    1.2.3  统计学方法  计量数据均以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 13.0软件包，两样本均数比较采用t检验；多样本均数比较采用单因素F分析。2  结  果    实验结束时，HLD对照组大鼠存活7只，各药物干预组各存活8只。    2.1  各组大鼠肝铜、24 h尿铜水平的比较  见表1。（1）肝铜水平：HLD对照组、各药物干预组较正常对照组显著增高（均P<0.01），各药物干预组较HLD对照组有不同程度的降低，差异有统计学意义（P<0.05～0.01），MPO组显著高于PCA组及MPO+PCA组（均P<0.01），MPO+PCA组较PCA组显著降低（P<0.05）；（2）24 h尿铜水平：HLD对照组、各药物干预组较正常对照组显著增高（P<0.05～0.01），各药物干预组较HLD对照组显著增高（P<0.05～0.01），MPO组显著低于PCA组（P<0.05），MPO+PCA组与PCA组间差异无统计学意义。表1  各组大鼠肝铜、24 h尿铜的比较  注：与正常对照组比较▲P<0.05，△P<0.01；与HLD对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与PCA组比较★P<0.05，☆P<0.01；与MPO组比较#P<0.01    2.2  各组大鼠肝功能的比较  见表2。（1）TP水平：各组间差异无统计学意义；（2）ALB水平：HLD对照组较正常对照组显著降低（P<0.05），各药物干预组较HLD对照组显著增高（P<0.05～0.01），且3个药物干预组间差异无统计学意义；（3）ALT水平：HLD对照组、PCA组、MPO组均较正常对照组显著增高（P<0.05～0.01），PCA组和MPO+PCA组较HLD对照组显著降低（P<0.05～0.01），MPO+PCA组较PCA组、MPO组显著降低（均P<0.05），与正常对照组相比差异无统计学意义；（4）AST水平：HLD对照组和MPO组较正常对照组显著增高（均P<0.01），各药物干预组较HLD对照组显著降低（P<0.05～0.01），且MPO+PCA组较MPO组降低更为显著（P<0.01），与正常对照组及PCA组相比差异无统计学意义。 表2  各组大鼠肝功能指标的比较注：与正常对照组比较△P<0.05，▲P<0.01；与HLD对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与PCA组比较★P<0.05；与MPO组比较#P<0.05，##P<0.013  讨  论    HLD是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病，由于转运铜的WD基因发生突变，其编码产物P型ATP酶（ATP7B）部分或全部丧失，导致铜过量沉积于脑、肝、肾等脏器［1，2］。蓄积在组织中的铜作为氧化物前体促进氧自由基和有害的脂质蛋白氧化物形成引起细胞损伤［3］。目前还没有一种动物模型可以完全复制HLD的全部临床特征，但可以确定的是铜负荷饮食可在大鼠肝、肾组织产生类似于HLD的铜沉积［4，5］。本实验中HLD对照组肝铜、24 h尿铜水平显著高于正常对照组，证明HLD模型具有类似于HLD的铜沉积。    肝铜及24 h尿铜水平是观察HLD疗效的客观指标［6］。在本实验中，各药物干预组肝铜水平较HLD对照组显著降低，24 h尿铜水平显著升高，说明各药物干预组均有减少肝铜沉积、促进尿铜排泄的作用。在3个药物干预组间，肝铜水平MPO+PCA组显著低于PCA组及MPO组， PCA组显著低于MPO组；24 h尿铜水平MPO+PCA组与PCA组间差异无统计学意义，但均显著高于MPO组。表明MPO的单巯基（SH）具有一定的络合重金属作用［7，8］，能够作为重金属中毒的解毒剂，促进铜、汞、铅等重金属从胆汁、尿、粪便排除，降低肝、肾蓄积量，保护肝功能和多种物质酶代谢；但是MPO络合作用仍较PCA弱，当MPO联合PCA时排铜效果优于单用PCA或MPO。    HLD患者由于蓄积于肝脏的铜产生大量的氧自由基，刺激过氧化产物形成，造成不同程度的靶细胞损害［3,9］。陈长寅等［10］的研究发现，MPO携带的游离巯基具有还原性，能化解体内过多氧自由基对细胞膜及细胞器膜的氧化破坏，同时能激活超氧化物歧化酶（SOD）的活性，加速氧自由基的清除。本实验发现HLD对照组ALT、AST水平较正常对照组显著升高，而各药物干预组ALT、AST水平较HLD对照组有不同程度的改善，证明了MPO能够对抗铜沉积造成的肝细胞氧化损害、改善肝功能； PCA能够络合肝铜而促进肝铜排泄，以减轻肝损害。由于MPO排铜能力较PCA弱，故MPO组肝功能改善程度较PCA组差，未能明显减少沉积铜对肝脏损害达到理想保肝效果。MPO+PCA组具有MPO抗氧化、改善肝功能和PCA排铜的双重作用，ALT、AST水平与正常对照组相比差异无统计学意义，达到理想的保肝效果。本实验中各组TP水平差异无统计学意义。各药物干预组ALB水平显著高于HLD对照组，与正常对照组差异无统计学意义。这是因为MPO具有促进肝细胞再生，促进蛋白合成，提高血清ALB水平的作用［10］；PCA通过对肝功能的保护而使ALB水平保持在正常水平。    综上所述，MPO联合PCA治疗HLD时排铜作用和改善肝功能效果最佳，优于PCA或MPO单用。此外，MPO还具有对抗HLD及PCA造成白细胞减少的不良反应［11］。因此，本研究结果为临床应用MPO联合PCA治疗HLD提供了实验依据。【参考文献】  ［1］吕达平，韩咏竹，王训，等.肝豆状核变性患者肝细胞中P型ATP7B酶水平及功能的研究［Ｊ］.临床神经病学杂志,2005,18:173.  ［2］Das SK,Ray K. 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