重组人粒细胞集落刺激因子对糖尿病脑缺血大鼠神经细胞凋亡及血管内皮生长因子表达的影响

重组人粒细胞集落刺激因子对糖尿病脑缺血大鼠神经细胞凋亡及血管内皮生长因子表达的影响作者：兰希发，张朝东，王雪，曲华，曹士蔚    作者单位：110001沈阳，中国医科大学附属第一医院神经内科    【摘要】  目的 探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)对糖尿病脑缺血大鼠神经细胞凋亡及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法 制备糖尿病大鼠大脑中动脉栓塞模型；对模型鼠采用rhGCSF 50 μg/(kg·d)皮下注射；分别于注射后7 d、14 d和21 d采用神经功能评分（NSS）量表进行评分；对脑组织切片予以TUNEL染色，计数脑缺血周边区神经细胞凋亡数；免疫组化法检测脑组织VEGF表达。结果 与对照组比较，rhGCSF组各时间点NSS明显降低(均P＜0.01)；脑缺血周边区的TUNEL阳性细胞数明显减少(均P＜0.01)；VEGF蛋白免疫阳性细胞明显增多(均P＜0.01)。结论 rhGCSF通过增加糖尿病脑组织缺血后VEGF蛋白的表达，减轻神经细胞的凋亡而发挥脑保护作用。    【关键词】  重组粒细胞集落刺激因子；神经细胞凋亡；糖尿病；脑缺血；血管内皮生长因子    Effects of  rhGCSF on the neuronal cell apoptosis and expression of VEGF after cerebral ischemia in diabetic rats  LAN Xifa, ZHANG Chaodong,WANG Xue, et al.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital to China Medical University,  Shenyang 110001，China    Abstract：Objective  To investigate the effects of rhGCSF on the neuronal cell apoptosis and expression of VEGF after cerebral ischemia in diabetic rats. Methods  Wistar diabetic rats were subjected to middle cerebral artery occlusion and randomly devided into control group and rhGCSF group. The rhGCSF group received subcutaneous injection of rhGCSF 50 μg/(kg·d) for 7 d, 14 d and 21 d after cerebral ischemia. Neurological severity scores(NSS), TUNEL, and immunohistological assessments of VEGF were performed to evaluate the rhGCSF treatment. Results  Compared with the control group, the rhGCSF group showed significantly improved in the NSS, significantly decreased in the TUNEL positive apoptotic neuronal cells and significantly increased in the VEGF positive neuronal cells (all P＜0.01). Conclusion  The rhGCSF can improve neurological function through inhibiting the neuronal cell apoptosis by increasing the expression of VEGF after cerebral ischemia in diabetic rats.    Key words：rhGCSF；neuronal cell apoptosis；diabetes；cerebral ischemia；VEGF    糖尿病并发脑梗死患者神经功能缺损严重。自体骨髓干细胞动员治疗,尤其是粒细胞集落刺激因子(GCSF)动员骨髓干细胞治疗急性心肌梗死的动物实验和临床研究已初显成效［1,2］,为急性脑梗死的治疗提供了新思路。本研究采用重组人GCSF（rhGCSF）干预，观察其对糖尿病局灶性脑缺血模型大鼠的神经功能缺损情况及脑组织缺血周边区域神经细胞凋亡、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，探讨rhGCSF神经保护作用的机制。1  材料与方法    1.1  材料  Wistar大鼠36只（中国医科大学实验动物部提供），质量200～250 g，雌雄不限；TUNEL试剂盒(Roche公司)；一抗为鼠抗人VEGF单克隆抗体(Santa Crutz公司)；SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；四氧嘧啶（Sigma公司）；rhGCSF（厦门特宝生物工程有限公司）。    1.2  方法    1.2.1  动物模型制备及分组  采用2次给药法制备大鼠糖尿病模型, 分别以120 mg/kg及100 mg/kg的剂量给予大鼠连续2 d腹腔注射四氧嘧啶，末次给药后72 h采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖,≥16.7 mmol/L为成功的糖尿病大鼠模型。6周后用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉糖尿病大鼠，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。大鼠苏醒后出现提尾时左侧前肢内收屈曲、爬行时向左侧划圈为模型成功。模型建立后将大鼠随机分为rhGCSF组和对照组，每组又分7 d、14 d和21 d 3个时间点，每一时间点为6只大鼠。    1.2.2  rhGCSF干预方法  rhGCSF组于MCAO术后每日颈部皮下注射rhGCSF 50 μg/kg，对照组相应时点皮下注射等量的生理盐水，直至处死日。    1.2.3  神经功能评分  采用Chen等［3］制定的神经功能评分(NSS)量表分别于MCAO术后1 d、7 d、14 d及21 d对大鼠进行运动、感觉、反射和平衡功能评分（0～18分），分数越高表明神经功能缺损越重。    1.2.4  脑组织VEGF检测  采用免疫组化方法，各组MCAO术后各时间点分别取6只大鼠，以10％水合氯醛麻醉，先后用肝素化生理盐水及4%多聚甲醛心内灌注，迅速断头取脑，以前囟为中心、冠状面±1 mm切取脑片，置于4%多聚甲醛中后固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，每隔100 μm连续作6 μm厚脑冠状面石蜡切片。石蜡切片进行免疫组化染色，具体步骤按照即用型SABC免疫组化试剂盒说明书操作。每只大鼠取两张切片，分别在高倍镜( ×400)下随机观察缺血侧额顶叶及纹状体区不重叠的5个视野，以细胞浆中有棕黄色颗粒为VEGF阳性细胞，分析阳性细胞光密度值(OD)。    1.2.5  神经细胞凋亡检测  采用TUNEL法，石蜡切片按照TUNEL试剂盒说明书操作，进行细胞凋亡染色。每只大鼠取两张切片，分别在高倍镜( ×400)下随机观察缺血侧额顶叶及纹状体区不重叠的5个高倍视野，细胞核中有棕黄色颗粒为TUNEL阳性细胞即凋亡细胞，计数TUNEL阳性细胞数。    1.2.6  统计学方法  数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 13.0软件进行两样本均数的t检验。2  结  果    2.1  各组各时点大鼠NSS的比较  见表1。rhGCSF组各时间点NSS明显低于对照组(均P＜0.01)。表1  各组各时点大鼠NSS的比较 注：与对照组比较*P＜0.01    2.2  各组各时点脑组织凋亡细胞数的比较  见表2及图1、2。rhGCSF组和对照组脑缺血周边区均可见TUNEL阳性细胞。rhGCSF组各时间点TUNEL阳性细胞数明显低于对照组(均P＜0.01)。表2  各组脑组织凋亡细胞数的比较 注：与对照组比较*P＜0.01    2.3  各组脑组织VEGF表达的比较  见表3及图3、4。rhGCSF组和对照组大鼠脑缺血周边区域均有VEGF阳性细胞表达，VEGF阳性细胞形态不一,有多    图1  对照组制模后21 d皮质可见大量TUNEL阳性细胞（×400）  图2  rhGCSF组制模后21 d皮质TUNEL阳性细胞数较对照组明显减少（×400）  图3  对照组制模后21 d皮质可见较多VEGF阳性细胞（SABC ×400）  图4  rhGCSF组制模后21 d皮质VEGF阳性细胞数较对照组明显增多（SABC ×400）    边形突起较长的细胞、球形细胞以及梭形细胞。rhGCSF组各时间点VEGF阳性细胞数明显高于对照组(均P＜0.01)。表3  各组脑组织VEGF表达的比较注：与对照组比较*P＜0.013  讨  论    GCSF是一种造血细胞生长因子，具有较强的动员骨髓干细胞的能力,可同时动员造血干细胞和间充质干细胞向脑梗死动物模型的梗死部位迁移，激活脑内成体神经干细胞，刺激其增殖和分化［4］;还能促进脑内各种神经营养因子的分泌［5］。研究［6］表明，急性脑梗死后人类脑组织中VEGF及其受体（KDR）的表达在梗死灶周边的缺血区域中增高显著，同时 VEGF mRNA也较梗死区和对侧正常半球的表达上调；VEGF所具有的特异的生物学作用为改善缺血性脑血管病缺血周围区血流供应提供了一个新的思路，直接引入外源性VEGF或通过药物或其他治疗手段间接促进VEGF合成及分泌可能有助于缺血缺氧组织中微血管的生成、改善局部血供以挽救濒死脑组织,减小梗死灶;促进慢性卒中模型神经功能的长期恢复［5,6］；GCSF作为一种新的神经营养因子，对脑卒中的治疗有着诱人的前景［7］。    糖尿病容易合并脑梗死，由于其血管损伤重，同时存在代谢障碍，因而神经功能缺损严重。本研究对糖尿病大鼠MCAO后予以 rhGCSF干预，结果显示NSS于7 d、14 d和21 d时均明显低于对照组，表明rhGCSF能够改善局灶性脑缺血糖尿病大鼠的神经功能。研究［8］认为GCSF改善神经功能的机制，除动员干细胞迁移、增殖和分化外，还能促进神经营养因子的分泌而发挥脑保护作用。也有研究［9］发现rhGCSF可增加脑缺血周边区涉神经巢蛋白(nestin)、MAP2和syn纤维结合蛋白的表达,减少神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达；增加缺血周边区神经元的分化、再生,并抑制星形胶质细胞的增生；syn纤维结合蛋白可以调节各种间质细胞的黏合、迁移和分化,并可增加脑缺血后Bcl2的表达,拮抗细胞凋亡［10］ 。由于凋亡是缺血性脑损伤重要的病理环节，故减少神经细胞的凋亡可以减轻脑损伤。本实验结果显示rhGCSF组各时点脑缺血周边区TUNEL阳性细胞明显少于对照组，VEGF表达明显高于对照组，缺血周边区VEGF蛋白免疫阳性细胞光密度值明显高于对照组，各时间点神经细胞的凋亡明显减少，NSS明显好于对照组。由此可见，应用rhGCSF干预可改善糖尿病大鼠脑缺血后的神经功能缺损，增加缺血灶周边区VEGF的表达,从而减少脑缺血周边区脑组织细胞凋亡。    由此推测，GCSF可能通过动员的造血干细胞向缺血区募集后，还能进一步分化成内皮细胞，促进血管再生［11］；通过促进神经细胞分泌VEGF，加强血管生成和神经再生，拮抗神经细胞凋亡［12］而发挥脑保护作用。【参考文献】［1］Harada M,Qin Y,Takano H,et al. 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