喉癌PCNA和survivin的表达与肿瘤化疗敏感性的关系

　　作者：利显民，江美芳 作者单位：(广东省深圳市宝安区人民医院耳鼻喉科，广东深圳518101)

　　【摘要】 目的 观察喉癌组织PCNA和survivin的表达水平与肿瘤化疗敏感性的关系。方法 随机选取36例喉癌，给予顺铂、5氟尿嘧啶和平阳霉素为方案联合化疗，取各例在治疗前的喉癌活检组织的石蜡标本，用免疫组化检测PCNA和survivin的表达情况，分析其表达水平与肿瘤化疗敏感性的关系。结果 喉癌组织中PCNA表达阳性者对化疗的敏感性明显高于PCNA阴性表达者(90.0% vs 37.5%，P<0.01);survivin表达阳性的喉癌组织与表达阴性的喉癌组织对化疗的敏感性则差异无统计学意义(65.2% vs 69.2%，P>0.05)。结论 PCNA的表达可能增强喉癌对化疗的敏感性，而survivin的表达对喉癌化疗敏感性可能无影响。

　　【关键词】 喉癌;化学治疗;PCNA;survivin;化疗敏感性

　　Relationships between expression of PCNA and survivin and chemosensitivity in laryngeal carcinoma

　　LI Xianmin，JIANG Meifang (Department of Otolaryngology , Baoan People's Hospital, Shenzhen 518101, China)

　　Abstract: Objective To observe the relationships between the expression of PCNA and survivin and the chemosensitivity in laryngeal carcinoma. Methods Thirtysix patients with laryngeal carcinoma received chemotherapy with a regimen of cisplatin, 52 fluorouracil and bleomycin, and their biopsy specimens were collected for detecting PCNA and survivin expression by immunohistochemical method. Results The chemosensitivity was significantly higher in patients with PCNA expression than that without expression (90.0% vs 37.5%, P<0.01), but there was no significant difference in the chemosensitivity between positive and negative survivin expression (65.2% vs 69.2%, P>0.05). Conclusion PCNA overexpression could enhance the chemosensitivity of laryngeal carcinoma.

　　Key words: laryngeal carcinoma; chemotherapy; PCNA; surviving

　　喉癌以手术治疗为主，并配合术前或术后放、化疗来缩小切除范围，以保全患病器官的功能和扩大手术的可行性[1]，然而喉癌对化疗的敏感性有所不同。要实现依据患者及癌肿对化疗敏感性的不同而制定不同的个体化治疗方案，首先必须找出一种快速、准确、灵敏的指标预测不同个体喉癌患者对化疗的敏感性，才能以此为依据制定相应的个体治疗方案。本研究拟随机选取喉癌病例，给予顺铂、5氟尿嘧啶和平阳霉素联合化疗，并取各例在治疗前的喉癌活检组织的石蜡标本，用免疫组化检测PCNA和survivin的表达情况，从而探讨PCNA和survivin的表达对喉癌化疗敏感性的影响。

　　1 资料和方法

　　1.1 观察对象

　　随机选取初诊为喉癌的患者36例，组织病理学证实均为鳞状上皮癌，其中高分化2例，低分化29例;男30例，女6例，平均年龄(60.0±8.1)岁。取活检前全部病例均未接受任何治疗。按照国际抗癌协会TNM分期的方案，36例中Ⅰ期6例，Ⅱ期15例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例。

　　1.2 免疫组化染色

　　取喉部肿瘤活检标本，分为2份，其中1份送组织病理学检查证实喉癌的诊断，另1份作免疫组织化学检测(下称免疫组化)。采用肾癌组织为阳性对照标本。将组织作厚度为5 μm的切片，经脱蜡等常规处理后，其中1张切片做HE染色，另1张做免疫组化用。简单的免疫组化的操作步骤如下：对切片加入1%H2O2甲醇溶液，抑制内源性过氧化物酶;在磷酸缓冲液( PBS)中洗5 min，共3次;滴加3%的非免疫马血清，在37℃保温20 min，阻断非特异性免疫结合反应;在PBS中洗涤，方法同前;滴加抗PCNA或survivin单克隆抗体(Santa Cruz产品)，稀释度为1∶50 溶液，37℃温育60 min后放在4℃冰箱中过夜;次日按前法用PBS 洗涤，再滴加生物素化羊抗鼠IgG单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司产品，1∶50 稀释)，在37℃中保温40 min;按前法PBS洗涤后滴加ABC复合物(北京中山生物技术有限公司产品，1∶50稀释)，37℃保温40 min;按前法用PBS洗涤，滴加新鲜配制的酶底物二氨基联苯二胺盐酸盐显色，最后用苏木素轻度复染。阳性对照标本，按上述步骤染色。阴性对照标本除以PBS代替第一抗体外，其它步骤与被测标本相同。

　　结果判断：光镜下观察到细胞核或胞浆内出现红棕色颗粒为阳性(PCNA在胞核，survivin在胞浆和胞核)，不染色为阴性。在切片四角和中央各选一高倍视野，各计数200个细胞。阳性细胞数≥10%者界定为阳性病例，阳性细胞数<10%者为界定阴性病例。

　　1.3 化学治疗

　　顺铂20～25 mg/m2，静脉滴注，每天1次，共3 d;甲酰四氢叶酸钙100 mg，静脉滴注，每天1次，共5 d;5氟尿嘧啶500～750 mg/m2，静脉滴注，每天1次，共5 d;平阳霉素8 mg溶于20 mL生理盐水内，静脉推注，每天1次，共4 d。每月循环1次，共3个月。

　　患者的化疗疗效按RECIST[2]评价标准。完全缓解(CR)：所有目标病灶消失，无新病灶出现，肿瘤标记下降至正常，并维持4周;部分缓解(PR)：所有(一个或多个)基线目标病灶最长径总和减少≥30%，并维持4周;疾病稳定(SD)：所有基线目标病灶最长径总和缩小但未达PR，或增大但未达PD;疾病进展(PD)：较已记录到得最小目标最长径总和增大≥20%，或出现一个或多个新病灶。本研究将CR及PR视为对化疗敏感，SD及PD视为对化疗不敏感。

　　1.4 统计学处理

　　采用确切概率法。

　　2 结果

　　2.1 化疗效果

　　36例喉癌，经顺铂、5氟尿嘧啶和平阳霉素联合化疗方案治疗后，对化疗敏感者有24例，占66.6%;对化疗不敏感者有12例，占33.3%。

　　2.2 PCNA在喉癌中的表达及其与喉癌组织化疗敏感性的关系

　　PCNA阳性表达信号位于细胞核，36例喉癌中，阳性表达者20例，占55.6%;阴性表达者16例，占44.4%。PCNA阳性组的化疗敏感性(90.0%)明显高于PCNA阴性组(37.5%)(P<0.01)，见表1。

　　2.3 survivin在喉癌中的表达及其与喉癌组织化疗敏感性的关系

　　survivin阳性表达信号位于细胞浆和细胞核，36例喉癌中，阳性表达者23例，占63.8%;阴性表达者13例，占36.2%。survivin阳性组的化疗敏感性(90.0%)与survivin阴性组的敏感性差异无统计学意义(65.2% vs 69.2%, P>0.05)，见表2。表1 喉癌组织PCNA阳性组与阴性组对化疗敏感性的比较表2 喉癌组织survivin阳性组与阴性组对化疗敏感性的比较 例(%)两组比较：P=1.000(确切概率法)。

　　3 讨论

　　化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要作用。化疗效果取决于肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。导致化疗失败的原因很复杂，存在着多种机制，例如肿瘤多药耐药性(MDR)是肿瘤细胞对抗癌药物表现出耐药性的作用机制之一，某些影响细胞的生长繁殖、凋亡的基因分子也影响肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。

　　PCNA是一种分子质量为36 000非组蛋白细胞核多肽，是DNA复制时聚合酶6的辅助成分，在细胞增殖中起着重要作用，其表达在G1期开始增高，s期达到高峰，G2期和M期明显下降。肿瘤细胞中PCNA含量反映了肿瘤增生能力的高低。有研究发现，晚期卵巢癌、腺癌、软组织肉瘤、骨肿瘤及宫颈癌等中的高PCNA表达病例的化疗效果较好，因而提出肿瘤细胞的PCNA表达水平可以预测某些肿瘤对化疗的敏感性[3]。survivin作为凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中结构独特的新成员，其分子量最小，但具有强大抗凋亡作用。survivin特异性表达于胚胎和胎儿组织及绝大多数肿瘤组织，但在终末分化的成人组织(除胸腺、生殖腺外)中不表达。多方面的研究提示，它与肿瘤的发生密切相关，且其表达往往与肿瘤的恶性程度、预后不良呈正向关系。反义survivin核酸降低survivin表达后，增强胃癌细胞对化疗药物多西他赛的敏感性[4]。PCNA和survivin的异常表达在喉癌的发生发展过程中起着重要作用，并且与喉癌的组织分化程度、临床分型、淋巴结转移密切相关，可作为喉癌的病理诊断及判断预后的参考指标[5]。

　　PCNA和survivin的异常表达可作为喉癌的病理诊断及判断预后的参考指标，那么，能否作为化疗敏感性的指标呢?在本实验中，我们发现PCNA表达阳性的喉癌组织对化疗敏感性明显高于PCNA阴性组(90.0% vs 37.5%, P<0.01), 说明PCNA在喉癌中表达可以增强肿瘤对化疗的敏感性。而survivin阳性病例与survivin阴性病例相比较, 喉癌对化疗的敏感性差异无统计学意义(P>0.05)，说明survivin的表达对喉癌化疗敏感性的影响不大。我们的研究结果提示, PCNA高表达可作为预测喉癌对化疗敏感的指标之一，而survivin的异常表达似不宜作为预测喉癌对化疗敏感的指标。但由于本实验所研究的病例数尚较少，需要增加病例做进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 刘世喜.喉癌治疗的现状[J]. 四川医学，2005，26(l2)：13511352.

　　[2] Therasse P, Arbuck S G, Eisenhauer E A, et al. New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors [J]. J Natl Cancer Inst, 2000, 92(3): 205216.

　　[3] 陈继明，王英红，郭晓青.预测官颈癌新辅助化疗敏感性及疗效细胞标志物[J].医学研究杂志，2007，36(3)：8384.

　　[4] 马荣，陈曦海，张岂凡，等.反义survivin核酸增强胃癌细胞对多西他赛敏感性及其逆转耐药机制的探讨[J].中华肿瘤杂志，2007,29(2)：8992.

　　[5] 杨娜，孙克巍，辛丁，等. Suivivin基因和增殖细胞核抗原在喉鳞状细胞癌中的表达及相关性研究[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志， 2006，l2(5)：326329.