COX2反义核酸对喉癌恶性生物学行为的抑制作用

　　作者：姚小宝，王晓侠，张少强，闫利英，朱宏亮 作者单位：1. 西安交通大学医学院第一附属医院耳鼻喉科，陕西西安 710061; 2. 解放军451医院耳鼻喉科，陕西西安 710054

　　【摘要】 目的 探讨环氧合酶2(COX2)反义核酸对喉癌细胞恶性表型的抑制作用。方法 采用脂质体介导方法，分别构建转染COX2反义真核表达载体和空载体的喉癌细胞系Hep2AS和Hep2P细胞。RTPCR及Western blot分析转染细胞COX2 mRNA及蛋白表达水平;MTT比色实验、Boyden侵袭小室法和裸鼠成瘤实验分别检测转染细胞的体外增殖速度、体外侵袭力和体内成瘤性。结果 RTPCR结果显示，Hep2AS细胞COX2/磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA比值(0.65)明显低于Hep2(0.92)和Hep2P细胞(0.90);Western blot结果提示Hep2AS细胞COX2/βactin比值(0.29)明显低于Hep2细胞(0.46)和Hep2P细胞(0.44);MTT比色实验显示Hep2AS细胞较Hep2P、Hep2细胞生长速度减慢，三者倍增时间分别为3.6d、2.9d和2.9d;体外侵袭实验结果表明，Hep2AS侵袭细胞数(18.20±5.97)显著低于Hep2细胞 (45.40±8.12)及Hep2P细胞(44.10±6.47)(P<0.01)。裸鼠成瘤实验中，Hep2P、Hep2细胞接种裸鼠后第5天肿瘤长出，而Hep2AS细胞第7天肿瘤长出;28d后Hep2AS细胞接种组瘤体体积[(764.85±129.61)mm3]低于Hep2细胞[(1181.73±360.83)mm3]和Hep2P细胞接种组[(1065.21±237.46)mm3]，有显著性差异(P<0.01)。结论 喉癌细胞中COX2过表达与细胞的恶性表型相关，反义核酸技术抑制COX2表达可以逆转喉癌细胞的恶性表型。

　　【关键词】 喉癌;核酸;环氧合酶2

　　by antisense nucleic acid of cyclooxygenase2YAO Xiaobao1, WANG Xiaoxia2, ZHANG Shaoqiang1, YAN Liying1, ZHU Hongliang1

　　(1. Department of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Department of Otolaryngology,

　　451 Hospital of PLA, Xian 710054, China)ABSTRACT: Objective To explore the effect of antisense nucleic acid of cyclooxygenase2 (COX2) in malignant phenotype of laryngeal cancer cells and the mechanism of COX2 in carcinogenesis of laryngeal cancer. Methods Using LipofectamineTM2000 reagent, the COX2 highly expressed in human laryngeal cancer cell line Hep2 was transfected with antisense eukaryotic expression vector pcDNA3.1/hCOX2 (-) and control plasmid pcDNA3.1 (named as Hep2AS and Hep2P cells, respectively). Semiquantitative RTPCR and Western blot were used to testify the mRNA and protein level in the transfected cells. MTT assay, Boyden chamber and tumor implantation experiment were used to detect the proliferation, invasion and tumorigenesis of the transfected cells in vitro and in vivo. Results RTPCR analysis indicated that the ratio of COX2 mRNA to GAPDH mRNA in Hep2AS cells (0.65) was significantly lower than that in Hep2 (0.92) and Hep2P cells (0.90) (P<0.01). Western blot showed that the ratio of COX2 protein to βactin protein in Hep2AS (0.29) was significantly lower than that in Hep2 (0.46) and Hep2P (0.44) (P<0.01). MTT assay suggested that the Hep2AS cells proliferated more slowly than the Hep2 and Hep2P cells with double time of 3.6, 2.9 and 2.9d, respectively. Boyden chamber assay revealed that the cell number of the Hep2AS cells (18.20±5.97) that migrated through the filter was smaller than that of the Hep2 (45.40±8.12) and Hep2P cells (44.10±6.47)(P<0.01). The tumor xenografts occurred on d5 in Hep2 and Hep2P cells, but on d7 in Hep2AS cells. On d30 after implantation, the volume of Hep2AS cell tumor xenografts [(764.85±129.61)mm3] was significantly less than that of Hep2 cells [(1181.73±360.83)mm3] and Hep2P cells [(1065.21±237.46)mm3] (P<0.01). Conclusion Overexpression of COX2 in human laryngeal cancer cell line Hep2 is associated with the malignant phenotype of cancer cells. Inhibition of COX2 expression by antisense technique can reverse the malignant phenotype of laryngeal cancer cells.

　　KEY WORDS: laryngeal neoplasm; nucleic acid; cyclooxygenase2 环氧合酶2(cyclooxygenase2, COX2)与人类肿瘤密切相关，文献报道喉癌组织有COX2的高表达[1]。流行病学研究及动物实验均表明非甾体类抗炎药(NSAID)对结肠、直肠癌具有防治作用[2]，并认为这种作用与抑制COX2有关。本研究通过反义核酸技术，抑制人喉癌细胞中COX2的异常表达，观察喉癌细胞生物学行为的改变，探讨COX2在喉癌发生及其恶性生物学行为中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人喉表皮样癌Hep2细胞系购自第四军医大学口腔医院生物学教研室。SPF级BALB/C小鼠,由第四军医大学实验动物中心提供并饲养。人COX2反义真核表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)由第四军医大学西京医院消化内科吴汉平构建[3]并惠赠。脂质体LipofectamineTM2000购自美国GibcoBRL公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，Boyden侵袭小室购自美国BD公司，羊抗人COX2多克隆抗体购自美国Santa Cruze公司。

　　1.2 细胞培养 Hep2细胞常规培养于含10mL/L灭活胎牛血清的RPMI l640培养液中，37℃、50mL/L CO2孵箱培养。

　　1.3 COX2反义核酸转染 接种Hep2细胞于6孔板培养至80%融合，转染前24h更换为无血清RPMI1640培养液。实验分3组：COX2反义核酸转染组，空载体pcDNA3.1对照组,未转染空白组。配制A液：250μL无血清RPMI 1640培养液(3组分别加入3μg pcDNA3.1/hCOX2(-)质粒、pcDNA3.1质粒或不加任何质粒)，B液：250μL无血清RPMI 1640培养液加入6μL脂质体LipofectamineTM2000。将3组A、B液混合，培养4h后，更换为含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养48h。各组细胞倍比稀释(1∶10，1∶50，1∶250)后接种至24孔细胞培养板，换用含G418筛选培养液继续培养2周后，随机挑取转染组及对照组细胞克隆，扩大培养2个月，分别命名为Hep2AS、Hep2P细胞，未转染空白组细胞仍称为Hep2细胞。

　　1.4 RTPCR COX2上、下游引物为：5′CCGAGGTGTATGTATGAGTG3′，5′AACTGATGCGTGAAGTGCTG3′;内参基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上、下游引物为：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′(由上海生物工程有限公司合成)。Trizol法提取稳定转染的Hep2AS、Hep2P和Hep2细胞总RNA，按试剂盒说明将2μg总RNA逆转录为cDNA，将cDNA产物进行PCR扩增，GAPDH终产物486bp，COX2终产物232bp。PCR产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳。

　　1.5 Western blot 收集对数生长期Hep2、Hep2AS、Hep2P细胞并进行裂解,依次行SDSPAGE，转印NC膜，80g/L脱脂奶粉TBS中37℃振摇1h，加入羊抗人COX2多克隆抗体(1∶1000)4℃摇床过夜，TBST洗涤后加入HRP兔抗羊IgG室温作用3h，增强化学发光法显色照相。

　　1.6 MTT比色实验 取对数生长期的Hep2、Hep2AS及Hep2P细胞，制备单细胞悬液，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板，每种细胞设6个复孔，并设空白对照。分别在接种后第1、3、5、7天进行MTT比色实验。

　　1.7 体外细胞侵袭力测定 采用Boyden侵袭小室法，按照文献[5]方法操作。37℃、50mL/L CO2条件下培养20h后，常规HE染色，200倍光镜下取5个视野，计数膜下方的细胞数。实验重复3次，取均数。

　　1.8 裸鼠移植瘤实验 随机分为3组，每组3只裸鼠，分别接种对数生长期的Hep2、Hep2AS及Hep2P细胞,细胞密度为4×107个/mL。抽取瘤细胞悬液接种于裸鼠背部皮下，每个部位注射0.2mL含活细胞数8×106。从接种之日起，观察裸鼠精神、饮食及体积变化情况。每7d测量肿瘤结节大小，计算肿瘤体积。28d后处死裸鼠，取瘤体测量肿瘤结节大小，计算肿瘤体积并固定，切片行HE染色，观察显微结构改变。

　　1.9 统计学处理 采用SPSS10.0统计分析软件，组间分析采用t检验，侵袭力测定分析采用单因素方差分析，移植瘤体积以±s表示，分析采用重复测量数据的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 人喉癌细胞COX2 mRNA表达 反义核酸转染引起人喉癌细胞COX2 mRNA表达下调。在对照GAPDH mRNA丰度基本相等的情况下，亲本Hep2细胞及空载体转染Hep2P细胞COX2 mRNA丰度基本相同，分别为110.8、108.6，而反义核酸转染Hep2AS细胞COX2 mRNA丰度明显降低，为83.8。Hep2AS细胞COX2/GAPDH mRNA比值(0.65)明显低于Hep2细胞(0.92)和Hep2P(0.90)(P<0.01，图1)。

　　2.2 人喉癌细胞COX2蛋白表达 反义核酸转染引起人喉癌细胞COX2蛋白表达下调。在对照βactin蛋白丰度基本相等的情况下，Hep2细胞与空载体转染Hep2P细胞COX2蛋白丰度基本相同，分别为45.2、43.8，而反义核酸转染Hep2AS细胞COX2蛋白丰度明显降低，为29.1。Hep2AS细胞COX2/βactin比值(0.29)明显低于Hep2细胞(0.46)和Hep2P细胞(0.44)(P<0.01，图2)。

　　2.3 反义核酸转染后人喉癌细胞增殖速度变化 Hep2AS、Hep2P、Hep2细胞的倍增时间分别为3.6、2.9、2.9d。提示Hep2AS细胞生长速度较Hep2P、Hep2细胞慢，差异有统计学意义(P<0.01)，而Hep2P与Hep2细胞生长速度比较无显著性差异(P>0.05)。

　　2.4 各组细胞侵袭力结果 反义核酸转染导致人喉癌细胞体外侵袭力下降。Hep2、Hep2P、Hep2AS组侵袭细胞数分别为34.5±6.21、32.01±5.79、16.02±7.59。提示Hep2细胞未转染组及空载体转染组细胞侵袭力相似，而反义核酸转染组细胞侵袭力显著低于前两者，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.5 裸鼠荷瘤实验结果 反义核酸转染导致人喉癌细胞体内成瘤性降低。Hep2和Hep2P细胞接种裸鼠后第5天可见肿瘤长出，Hep2AS细胞接种裸鼠后第7天可见肿瘤长出。第9天开始测量肿瘤体积，以后每7d测量1次(表1)。方差分析表明，转染反义核酸的细胞成瘤性显著低于未转染细胞及转染空载体对照细胞，差异有统计学意义(P<0.01)。各组裸鼠移植瘤的HE染色未见明显差异(图3)。表1 各组荷瘤鼠肿瘤体积的比较

　　3 讨 论

　　近年的研究发现，结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌等多种人类肿瘤COX2的表达明显增高，抑制COX2表达有可能预防和逆转肿瘤发生，表明COX2在肿瘤的发生发展过程中起重要作用[45]。

　　COX是催化花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，有3种同工酶形式：COX1、COX2和COX3。COX1呈组成性表达，由看家基因编码，与正常细胞的前列腺素合成有关;COX2为诱导性表达，正常情况下多数细胞中不表达，仅在炎症状态受细胞因子和有丝分裂原刺激等情况下表达增强;COX3是新近发现的COX1剪切变异体，在人类大脑皮质及心脏有丰富表达[6]。

　　COX2抑制剂阿司匹林、舒林酸或尼美舒利可降低啮齿类动物化学致癌模型中膀胱癌的发生率，表明COX2可促进膀胱癌的发生[78]。OKAJIMA等[9]研究发现选择性COX2抑制剂可明显抑制表达COX2的裸鼠移植瘤生长。王佳蓉等[1]观察76例原发性喉癌中COX2表达情况，COX2阳性表达组血管生成明显多于阴性表达组，证实COX2可促进肿瘤区域的血管增殖，从而参与喉癌血管生成，促进肿瘤生长。本实验选择COX2高表达的喉癌细胞系Hep2作为研究对象，利用反义核酸技术，将COX2编码cDNA序列反方向插入真核表达载体并转入COX2高表达的喉癌细胞，使之在胞内稳定、持续转录COX2基因的互补RNA链以封闭靶基因，从而制备了目的基因表达持续下调的细胞模型。虽然反义核酸技术目前由于载体的安全性、靶向性等实际问题而距临床应用尚有较远的距离，但仍不失为一种研究特定基因功能有效的实验方法。利用脂质体介导的基因转染方法，初步获得了稳定表达COX2反义RNA的喉癌细胞，通过RTPCR及Western blot方法证实其COX2 mRNA及蛋白表达水平显著下降。MTT比色实验显示反义核酸转染细胞体外增殖速度明显低于亲本细胞Hep2。Boyden侵袭小室法比较反义核酸转染前后细胞体外侵袭力改变,结果发现反义核酸转染细胞体外侵袭力显著低于未转染细胞及转染空载体细胞，说明COX2基因表达可促进喉癌细胞侵袭转移，是肿瘤细胞侵袭转移能力的一个正调控因子，抑制COX2基因表达可抑制喉癌细胞侵袭转移。裸鼠成瘤实验亦表明反义核酸转染细胞体内成瘤性下降，进一步证实了COX2的促癌作用。以上结果均表明COX2高表达确实与肿瘤细胞增殖、致瘤、侵袭转移等恶性表型密切相关,是引起肿瘤细胞恶性表型的相关基因之一。目前许多抗肿瘤药物临床疗效不理想，原因之一可能是肿瘤细胞表达COX2增加，诱导抗凋亡基因Bcl2的表达。因此，开发特异性COX2抑制剂将为喉癌防治开辟新的方向。

　　【参考文献】

　　[1]王佳蓉，张白凌，张鹏飞. 环氧合酶2与血管内皮生长因子在喉癌的表达及意义 J]. 福建医科大学学报, 2006, 40(2):136138.

　　[2]MAIER TJ, SCHILLING K, SCHMIDT R, et al. Cyclooxygenase2 (COX2)dependent and independent anticarcinogenic effects of Celecoxib in human colon carcinoma cells [J]. Biochem Pharmacol, 2004, 67(8):14691478.

　　[3]吴汉平，吴开春，李玲，等. 人环氧合酶2(COX2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究 [J]. 世界华人消化杂志, 2000, 8(11):12111217.

　　[4]OKAJIMA E, UEMURAH, OHNISHI S, et al. Expression of cyclooxygenase2 in primary superficial bladder cancer tissue may predict risk of its recurrence after complete transurethral resection [J]. Aktuelle Urol, 2003, 34(4):256258.

　　[5]WULFING C, ELTZE E, VON STRUENSEE D, et al. Cyclooxygenase2 expression in bladder cancer: correlation with poor outcome after chemotherapy [J]. Eur Urol, 2004, 45(1):4652.

　　[6]CHANDRASEKHARAN NV, DAI H, ROOS KL, et al. COX3, a cyclooxygenase1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, and expression [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(21):1392613931.

　　[7]ROMSING J, MOINICHE S. A systematic review of COX2 inhibitors compared with traditional NSAIDs, or different COX2 inhibitors for postoperative pain [J]. Acta Anaesthesiol Scand, 2004, 48(5):525546.

　　[8]RAO KV, DETRISAC CJ, STEELE VE, et al. Differential activity of aspirin, ketoprofen and sulindac as cancer chemopreventive agents in the mouse urinary bladder [J]. Carcinogenesis, 1996, 17(7):14351438.

　　[9]OKAJIMA E, DENDA A, OZONO S, et al. Chemopreventive effects of nimesulide, a selective cyclooxygenase2 inhibitor, on the development of rat urinary bladder carcinomas initiated by NbutylN(4hydroxybutyl) nitrosamine [J]. Cancer Res, 1998, 58(14):30283031.