高脂饮食对血管平滑肌细胞KATP通道功能的影响

　　作者：田红燕，范力宏，杨妙丽，胡 志，白晓君，马爱群，曹永孝 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第一附属医院心内科，陕西西安 710061; 2. 第二附属医院耳鼻喉科，陕西西安 710004;3. 药理学系，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 观察高脂饮食对血管平滑肌的KATP通道功能的影响，探讨KATP通道在肥胖引起的可逆性高血压发病机制中的作用。方法 高脂饲料喂养大鼠，获得肥胖模型;20周后，其中10只转为普通饲料喂养，而另外10只继续喂养高脂饲料，实验继续10周。对照鼠为普通饲料喂养30周大鼠。30周时，处死大鼠，采用肌张力描记系统，膜片钳技术检测KATP通道的功能。结果 KATP通道电流及其介导的血管舒张反应在高脂鼠中明显降低，但转为普通饮食后，这些损伤被修复。结论 高脂饮食可引起大鼠血管平滑肌KATP通道功能的可逆性损伤，这可能是肥胖调节血压的一条潜在途径。

　　【关键词】 肥胖;KATP通道;肠系膜动脉;高血压;血管平滑肌细胞

　　BAI Xiaojun1, MA Aiqun1, CAO Yongxiao3

　　(1. Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. ENT Department, the Second Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004; 3. Department of Pharmacology,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effect of highfat dietinduced obesity on KATP channels in vascular smooth muscle cell (VSMC) and blood pressure. Methods Obesity was induced in rats by highfat diet for 20 weeks. Then these rats were divided into two groups. One group was fed with a highfat diet and the other group was fed with standard chow for 10 more weeks. Control rats were fed with standard laboratory rat chow. Function and expression of KATP channel in mesenteric arteries were characterized using myograghic system and patch clamp, respectively. Results The results indicated that highfat diet decreased function and expression of KATP channel in rat mesenteric arteries and increased blood pressure in rats. After conversion to a standard chow for 10 weeks, most of these effects were restored. Conclusion Highfat diet impaired KATP channel in VSMC, which may underscore reversible hypertension induced by highfat diet, at least in part.

　　KEY WORDS: obesity; KATP channel; mesenteric artery; hypertension; vascular smooth muscle cell

　　肥胖是高血压发生的一个重要危险因素，两者呈线性相关[1]。但是，肥胖导致高血压的具体机制还不清楚。血管平滑肌组织的KATP通道可影响细胞的静息膜电位，在调节血管阻力及血压中起着重要作用。大量的资料已证实，KATP通道的功能与高血压的发生密切相关。KATP通道不仅存在于血管平滑肌组织，在胰岛β细胞、脑神经元细胞等也有广泛表达。近年来的研究发现，肥胖导致的糖脂代谢紊乱和大量脂肪因子(包括炎症因子)的分泌可抑制胰岛β细胞和脑神经元KATP通道的功能[23]。所以，肥胖也有可能通过影响血管平滑肌细胞KATP通道而影响血压。但是，尚缺乏关于肥胖对血管平滑肌细胞KATP通道影响的直接研究。本研究就是通过检测肥胖大鼠动脉平滑肌细胞的KATP通道功能来验证上述假设。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 选择健康雄性SD大鼠30只，体重(140±5)g。随机抽取20只，以高脂饲料喂养，获得肥胖大鼠模型(DIO组)。另外10只，以普通饲料喂养，做为对照组。喂养20周后，高脂饲料喂养的20只大鼠再随机分为两组，一组继续以高脂饲料喂养(DIOHF)，而另一组则改为普通饲料喂养(DIOSD)。再喂养10周。所以在实验的第30周末，共有三组大鼠：DIOHF组(n=10)、DIOSD组(n=10)、对照组(n=10)。高脂饲料组成为：48.65%脂肪，1.2%胆固醇，20%蛋白，30.15%碳水化合物[1]。大鼠购自西安交通大学医学院动物实验中心。喂养满30周后，大鼠麻醉后处死。肠系膜动脉和内脏白色脂肪组织迅速分离。以0.1mmol/L Triton X100冲洗部分肠系膜动脉以去除血管内皮。这些组织直接使用或迅速冷冻保存。

　　1.2 血压、体重与血清学的检测 以无创测压系统(ABI公司，美国)测定大鼠鼠尾血压[1]。血压以平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)表示，每次血压测定3遍，取其平均值。在20周末、30周末，分别检测血甘油三酯(triglyceride, TG)、胆固醇(total cholesterol, TC)、游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)、血糖浓度[2]。血样取自鼠尾静脉(取血前大鼠禁食12h)。离心后将血清保存于-80℃冰箱。

　　1.3 血管舒张反应的测定 采用新鲜的处理好的血管(包括去内皮的和保留内皮的两种)，将其剪成约1mm长的动脉环，套在两个L型的金属针上，置入Krebs液(mmol/L)：60 NaCl、15 NaHCO3、63.5 KCl、1.2 MgCl2、1.2 NaH2PO4、1.5 CaCl2和5.5葡萄糖，37℃恒温水浴，其中一个连接FT03C张力换能器(Grass Instrument Co. Quincy，美国)，另一个连接微调装置(调节负荷张力)。持续通入含95%(体积分数)O2和5%(体积分数)CO2的混合气体，使pH保持7.4左右，平衡1h后开始实验。以60mmol/L KCl预收缩动脉环，收缩持续稳定后累加浓度法加入KATP通道开放剂：吡那地尔(Pin：10-10～10-3mol/L)，获得剂量舒张反应曲线。Pin诱发的舒张用相对于预收缩剂产生收缩效应的百分比表示(吡那地尔和格列苯脲均购自Sigma公司)。

　　1.4 细胞分离及电生理学实验 本实验采用一步法分离动脉平滑肌细胞。将分离干净的新鲜动脉置入低钙分离液中剪成1～3mm的碎块，于室温下静置平衡20min。然后将血管碎块转移至2mL的酶分离液，37℃恒温水浴箱内振荡消化15～20min，低钙液冲洗3～4遍，巴斯德吸管轻轻吹打，获得单个细胞，加5g/L牛血清白蛋白4℃保存，4～5h内使用。

　　使用膜片钳全细胞记录方式记录细胞电流。将细胞放于倒置相差显微镜载物台上，选择折光性好，胞核清晰的细胞进行实验。所有记录电流经Axopatch 200B膜片钳放大器放大，Digidata1320A(Axon Instruments;美国)输入计算机，pClamp 7.0软件分析处理数据。电极用玻璃毛细管经微电极拉制仪(PP2830，日本)分两步拉制，抛光充灌电极内液后电极阻抗为5～8MΩ，待电极与细胞达到千兆欧姆时封接、破膜。膜电容和串联电阻均经放大器补偿，以-80mV钳制膜电位，给予从-60mV～+60mV的方波刺激，步幅为10mV，采样软件为pClamp8.0，采样频率为5kHz。高钾细胞外液灌流30～60s诱发VSMC的KATP通道电流，KATP电流可被10μmol/L Pin激活，而被10μmol/L Glib抑制，格列本脲敏感电流为KATP通道电流。电流值以电流幅值与膜电容相比即电流密度(pA/pF)表示。5mmol/L钾细胞外液(mmol/L)：135 NaCl，5.4 KCl、1.2 MgCl2、0.1 CaCl2、10 HEPES、和10葡萄糖，pH 7.4/NaOH。高钾细胞外液为将上述溶液中NaCl由KCl取代而配制。电极内液(mmol/L)：140 KCl、10 HEPES、10 EGTA、1.2 MgCl2、1 CaCl2、0.1 Na2ATP、1 MgADP、0.1 Na2 GTP (pH 7.4/KOH)。

　　1.5 统计学处理 用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料采用±s表示，三组间的比较采用方差分析，两组间的比较用独立样本t检验。

　　2 结 果

　　2.1 高脂饮食大鼠的一般特征的比较 在20周末，高脂饮食大鼠(dietinduced obesity, DIO)的体重和血压明显高于对照鼠。血清游离脂肪酸、甘油三酯和胆固醇浓度在DIO鼠也明显升高。在30周末，高脂鼠(high fat dietinduced obesity, DIOHF)的这些指标进一步升高，但转为10周普通饮食后的高脂鼠(dietinduced obesitystandard diet, DIOSD)，虽然体重依然高于对照鼠，但血压、内脏脂肪重量和血脂水平明显降低，和对照鼠相似(图1)。

　　2.2 高脂饮食对Pin引起的血管舒张反应的影响 Pin可浓度依赖性地引起血管舒张反应，这种反应可被格列苯脲(10-5mol/L)抑制。Pin引起的舒张反应在DIOHF大鼠的肠系膜动脉明显降低。和对照鼠相比，DIOHF大鼠的Emax降低而EC50则升高。但是，这些变化在DIOSD大鼠中不明显，DIOSD大鼠的Emax和EC50值和对照鼠的无显著性差异。Pin引起的舒张反应在同一组大鼠的去内皮和保留内皮肠系膜动脉上无显著性差异(表1、图2)。图1 正常饮食大鼠和高脂饮食大鼠的一般特征的对比表1 高脂饮食对Pin引起的血管舒张反应的影响

　　2.3 高脂饮食对血管平滑肌细胞KATP电流的影响 IKATP随膜电位的上升而上升。在高K+液中，对照组，DIOSD、DIOHF大鼠的KATP电流(格列苯脲敏感性电流)分别为(-7.04±1.15)pA/pF、(-6.43±0.92)pA/pF、(-3.96±0.84)pA/pF(膜电位-60mV时)。KATP电流可被10μmol/L的Pin激活，而被10μmol/L的Glib抑制。Pin诱发的KATP电流在三组大鼠分别为(-25.21±5.07)pA/pF、(-22.30±4.28)pA/pF、(-11.87±2.31)pA/pF。这些资料表明，KATP电流在DIOHF大鼠的血管平滑肌细胞显著降低，但高脂鼠转为普通饮食后可修复这一受损电流。DIOHF与对照组或DIOSD组相比，P<0.01;DIOSD与对照组相比，P>0.05，图3)。

　　3 讨 论

　　本研究的主要发现为肥胖可升高血压，抑制KATP介导的血管舒张反应和VSMC的KATP电流，但转为普通饮食后这些变化及升高的血压可恢复。本研究观察到的饮食对大鼠血压的变化，即高脂饮食可导致肥胖，升高血压，但转为标准饮食一段时间后，DIOSD大鼠的血压、内脏脂肪重量、血脂水平则降低。这与以往其他高脂饮食的研究结果一致[1,4]。

　　尽管大量证据表明高脂饮食可升高血压，但其具体机制尚不明了。其中血管阻力的增加是高脂饮食升高血压的一个重要途径。肥胖可引起一系列代谢紊乱、交感神经兴奋、脂肪因子分泌异常，这些都与血管张力升高有关。血管张力是大动脉、小动脉及微血管动脉壁上的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的一种收缩活动。它是血液流经循环系统过程中受到阻力的主要决定因素之一。因此，血管张力在血压调节及血液在各组织、器官间及组织、器官内分配的调节中起着重要作用。VSMC收缩活动的调节受到来自循环血液中的激素、神经递质、内源性因子及血流动力学(切应力及跨壁压)变化等几个因素的复杂的交互作用。VSMC整合这些信号以确定其收缩装置的活动，并进一步影响着血管的阻力和血压。在此过程中离子通道起着核心作用。与所有肌细胞一样，VSMC通过Ca2+启动收缩装置。细胞膜上离子通道的Ca2+内流及内储Ca2+的释放是细胞内Ca2+的主要来源。另外，通过离子通道的离子运动在很大程度上决定着膜电位。膜电位及胞浆内的Ca2+浓度共同调节并控制着通过离子通道的Ca2+内流、Ca2+释放剂收缩装置对Ca2+的敏感性。

　　血管平滑肌的KATP通道是调节细胞内Ca2+浓度的一个重要通道，KATP通道开放可使细胞膜电位超极化，从而抑制电压依赖性Ca2+通道，减少Ca2+内流，舒张血管。虽然在生理条件下，KATP通道处于低开放状态，但许多血管活性因子，如血管紧张素II 、生长素，是通过调节KATP通道电流而发挥作用的。大量的研究证明VSMC KATP通道功能降低可升高血压[56]。本研究观察到KATP通道电流及其介导的血管舒张反应在高脂鼠中(DIOHF)明显降低。去除动脉内皮不影响Pin引起的血管舒张反应，这与以往的研究结果一致，表明主要是血管平滑肌中的KATP通道在KATP通道调节动脉张力中发挥作用。本研究系首次检测肥胖对血管平滑肌KATP通道功能的影响。但是，以往研究发现细胞外高糖可抑制β细胞和脑神经元的KATP通道功能[23,7]，这些相关研究支持我们的结果，同时也提示了肥胖影响KATP通道的途径。图3 高脂饮食对大鼠血管平滑肌细胞KATP电流的影响当高脂鼠转为普通饮食后，受损的KATP通道功能修复，升高的血压也下降。尽管高脂饮食影响血压的机制是复杂的，但我们的实验资料表明，高脂饮食可引起血管平滑肌KATP通道功能的可逆性降低。这可能是高脂饮食影响血压的机制之一。除此而外，这个结果还表明了低脂饮食的益处。

　　肥胖损伤血管平滑肌功能的具体机制还不清楚。综合以往的研究发现和本研究的结果，推测可能和以下因素有关。肥胖可使游离脂肪酸浓度升高，而游离脂肪酸可激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)信号转导途径，PKC是KATP通道的重要上游调节因子[89]。高脂饮食还可损伤内皮[4]，抑制NO(nitrogen oxide)的合成。NO可以通过cGMP信号途径调节KATP通道。还有研究证实细胞外高糖可抑制KATP通道功能。近来还发现炎症因子可改变大鼠结肠平滑肌细胞KATP通道的功能和表达[10]。现在的研究已证实肥胖是一种低炎症状态[11]，脂肪组织可分泌大量炎症因子。那么，这些因子是否对血管平滑肌的KATP通道有影响值得进一步的研究。

　　总之，本研究的结果表明，高脂饮食可逆性地损伤了血管平滑肌的KATP通道功能，这可能是肥胖升高血压的一条潜在途径。

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