内耳干细胞培养、移植实验研究

　　作者：邰浩清 作者单位：南京中医药大学解剖组织学教研室，江苏南京210029

　　【摘要】 目的 通过移植内耳干细胞入中毒性耳聋模型大鼠内耳，观察内耳干细胞的生长、整合等情况。方法 选用健康SD大鼠20只，连续10天肌内注射中等度中毒剂量的庆大霉素〔80 mg/(kg·d)〕，制作中毒性耳聋动物模型。实验分为2组，每组10只。干细胞组：移植用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的耳蜗干细胞，观察移植后的内耳干细胞存活、增殖能力;用流式细胞仪测定移植后内耳组织CD4(+)T细胞占整个淋巴细胞的百分比。生理盐水组：耳蜗内注入生理盐水，观察同上。结果与结论 移植到中毒性耳聋模型鼠内耳的内耳干细胞能够向周围扩散、存活，而且有一定的增殖能力，表现为正常的毛细胞形态;移植后内耳组织CD4(+)T细胞占整个淋巴细胞百分比与移植前差异无显著性〔(48±5)% vs. (45±6)%，P>0.05〕，移植后的排斥反应不明显。

　　【关键词】 内耳干细胞 培养 移植 中毒性耳聋 动物模型 大鼠

　　长期或过量使用链霉素、庆大霉素及丁胺卡那霉素等类药物导致的中毒性耳聋是临床常见的药物副作用。根据国家食品药品监督管理局统计，每年我国因药物造成听力损害的患者高达数百万人。经研究发现其致病机制主要为：耳毒类药如氨基甙类抗生素可抑制ATP 酶的活化,使内、外淋巴液中K+、Na+ 倒置, 引起膜通透性改变和多种水解酶释放, 最终使内耳毛细胞萎缩、变性、坏死，而且内耳毛细胞损伤通常是不可逆的。近年来,随着神经干细胞研究的不断深入，已有研究表明：内耳损伤后外源基因刺激可以产生新的毛细胞。因而，通过促进耳源性神经干细胞向毛细胞转化,利用其本身的分化特性, 重建毛细胞形态和神经连接, 恢复毛细胞功能也许是治疗中毒性耳聋的有效途径之一。本实验通过移植内耳干细胞入中毒性耳聋模型大鼠内耳，观察移植后的内耳干细胞生长、整合等情况，为治疗中毒性耳聋提供实验理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 选用健康SD大鼠20只，雌雄不限，体重350～400 g，由南京中医药大学实验动物中心提供。

　　1.2 试剂和抗体 Neurobasal培养基、B27辅助培养基(GIBCO公司)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Sigma公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、巢蛋白(nestin)抗体(Sigma公司)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)及其单克隆抗体(Sigma公司)。

　　1.3 主要仪器 离心机、超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、荧光显微镜、FACS Calibur型流式细胞仪(BD公司)等。

　　1.4 中毒性耳聋模型的建立 听耳廓反射和前庭功能正常的大鼠给予硫酸庆大霉素肌内注射。选用中等度的中毒剂量80 mg/(kg·d)，连续使用10天。经听耳廓反射测定器检查判定鼠的听力下降程度以及耳蜗切片观察耳蜗损伤状况，特别是内耳毛细胞崩解的程度，确定造模成功与否。

　　1.5 实验分组 本实验随机分为2组，每组10只：干细胞组，行干细胞耳蜗内移植;生理盐水组，耳蜗内注入生理盐水。

　　1.6 耳蜗干细胞的分离、培养及鉴定

　　1.6.1 耳蜗干细胞取材 水合氯醛深度麻醉P0大鼠(胚鼠),无菌操作条件下分离内耳耳蜗。经碘酊、乙醇消毒后固定于烛台, 去外膜,在解剖显微镜下操作,剪去动物耳廓及外耳道(外耳道为软骨性) ,暴露鼓膜,透过菲薄的鼓膜可见到听骨链。用耵聍钩沿鼓膜下缘6点处进针,钩住下鼓室部位稍用力迅速将颞骨乳突部连同鼓膜整块摘除，暴露出鼓岬及其前下方的蜗锥,摘除听骨,刺破两窗膜(圆窗和卵圆窗)，用眼科剪剪开耳蜗前方的薄层骨连接至颅内,通过此口用耵聍钩入颅内向后外方骨折取出完整的内耳标本,剪去连接的颞肌, 找到大鼠耳蜗内螺旋沟及内毛细胞下方区域并取材。HBSS液冲洗几次后剪碎,加入0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min。中止反应之后加入0.01% DNA 酶,吸管轻柔吹打成单细胞悬液。

　　1.6.2 耳蜗干细胞培养 无血清培养基进行培养〔DMEM/F12(1∶1)液 +2% B27 + bFGF 20 μg/L+表皮生长因子(EGF) 20 μg/L〕。待原代克隆形成后分离克隆制作单细胞悬液，按1×108/L 接种培养。7天后将其移至离心管中，500 r/min 离心, HBSS液洗涤,去上清,余液混匀,涂于多聚赖氨酸包被的载片上,晾干, 4%多聚甲醛固定。

　　1.6.3 耳蜗干细胞鉴定[1-2] 免疫荧光细胞化学染色法,用抗巢蛋白抗体 (1∶200) 以及BrdU标记内耳干细胞，荧光显微镜下观察并拍照记录。

　　1.7 耳蜗干细胞耳蜗内移植 将中毒性耳聋模型鼠麻醉后，在无菌条件下，用微量注射器将经BrdU标记的内耳干细胞沿耳蜗壁或者圆窗和卵圆窗注射入内耳耳蜗结构。对照组耳蜗内注射生理盐水，方法同上。

　　1.8 取材与观察 移植4周后，取大鼠内耳移植部位的组织，剪切，1%胰酶充分消化30 min，过滤，离心洗涤5 min，弃上清，沉淀以PBS制成细胞悬液，流式细胞仪计数分析。制作实验动物内耳的组织切片及耳蜗铺片，在荧光显微镜下观察内耳组织结构的变化。

　　1.9 统计学处理 所有数据均采用SPSS软件包进行t检验。P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 内耳干细胞的培养及鉴定 取自 P0大鼠内耳的内耳干细胞在无血清培养基中，镜下观察刚分离的单细胞呈圆形，大小不一，折光性好，悬浮在培养瓶中，无突起长出。培养1天少数细胞伸出突起，3～4天贴壁的细胞突起伸长，5～6天细胞的突起相连交织成网。将离心后的细胞重新制备成单细胞悬液，6～7天后可见大量悬浮的细胞团形成，细胞团中有很多生长状态良好的单个细胞，呈桑葚形状。上述细胞球经巢蛋白免疫荧光鉴定呈阳性，表明分离培养的细胞是具有自我更新能力的干细胞。BrdU特异性标记细胞核，细胞团打散后，可观察到大量BrdU标记阳性的干细胞，说明这些细胞是具有增殖能力的内耳干细胞。继续培养后，有些克隆球自然贴壁， 并沿球体周围伸出突起向四周呈放射状延伸。细胞球贴壁后，少数细胞从球体迁移出来，细胞形态不规则，呈三角形、锥形或多角形(图1)。

　　2.2 内耳组织CD4(+)T细胞计数 用流式细胞仪计数分析，移植后内耳组织CD4(+)T细胞占整个淋巴细胞百分比与移植前差异无显著性〔(48±5)% vs. (45±6)%，P>0.05〕。

　　2.3 内耳的镜下表现 在荧光显微镜下：生理盐水组表现为毛细胞核消失，在毛细胞核的位置出现染色空白区; 而干细胞组发现有大量BrdU标记阳性的内耳干细胞在移植区域，部分存活的内耳干细胞迁移至耳蜗毛细胞表面, 形态上与内、外毛细胞相似(图2)。

　　3 讨 论

　　Li等[3]在成年大鼠椭圆囊斑位置发现存在内耳干细胞, 内耳干细胞在体内和体外培养可分化成毛细胞样细胞，而且拥有高度的增生潜能和自我更新能力[4]。 Malgrange等[5]采用无血清培养基加丝裂原性生长因子( EGF或bFGF)从P0大鼠耳蜗和内耳螺旋沟区域分离培养出巢蛋白阳性的神经细胞球, 分裂后分化为耳蜗毛细胞和支持细胞, 提示这些巢蛋白阳性细胞可能是出生后损伤的Corti 器内新生毛细胞和支持细胞的来源。Ozeki等[6]也分别从E12和P5大鼠的耳泡和Corti器分离出永生化的毛细胞前体细胞系。

　　我们选择在前期实验中已得到证实的内耳Corti器位置取材，通过巢蛋白(早期神经上皮细胞的标志)以及BrdU(在细胞分裂前DNA的合成期，它可作为底物参与DNA的合成)标记，证明我们取材获得的细胞是具有增殖能力的干细胞。将获得的内耳干细胞移植前加BrdU(10 μmol/L)共培养72 h后，用微量注射器将耳蜗干细胞沿耳蜗壁或者圆窗和卵圆窗注射入内耳耳蜗内，镜下观察移植后4周大鼠内耳组织。其中生理盐水组表现为毛细胞核消失，在毛细胞核的位置出现染色空白区或毛细胞核肿胀，核体积明显增大，染色变淡，且不均匀，有些肿胀细胞核外形不规则[7]，表明毛细胞损伤是中毒性耳聋的前提;而干细胞组可见大量BrdU标记阳性的干细胞从移植区域向周围扩散，部分存活的内耳干细胞迁移至耳蜗毛细胞表面, 形态上与内、外毛细胞相似, 移植的细胞团外围与受体胶原有很好的融合，表明移植的内耳干细胞不仅能够存活[8]，而且有一定的增殖能力。

　　用流式细胞仪计数分析，内耳组织CD4(+)T淋巴细胞的百分比与移植前没有明显变化，表明移植后排斥反应较轻[9]。这主要是由于内耳干细胞与其他干细胞一样是一种非常原始的细胞，它们较低的免疫原性不会引起明显的排斥反应。

　　本实验结果显示：移植到中毒性耳聋模型大鼠内耳的内耳干细胞能够向周围扩散、存活，而且有一定的增殖能力;移植的细胞团外围与受体胶原有很好的融合，表现为正常的毛细胞形态。至于这种表现为内耳毛细胞形态的细胞能否重建毛细胞神经连接, 恢复毛细胞功能，是我们后期研究的内容。另外，由于属于同种同源性移植[10-11]，加上内耳干细胞又是一种非常原始的细胞，它的免疫原性较低，移植后的排斥反应没有想象的严重。

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