初发鼻咽癌与复发鼻咽癌差异表达基因的研究

　　作者：黄振校，李文峰，杜季梅，黄亚，谭映霞，方渭清，廖志苏 作者单位：温州医学院，浙江 温州 325027，1.附属第一医院 耳鼻喉科;2.附属第一医院 放疗科;3.检验医学院;4.附属第一医院八院区 耳鼻喉科

　　【摘要】 目的 ：通过全基因组基因芯片研究初发鼻咽癌(pNPC)与复发鼻咽癌(rNPC)之间的差异表达基因。方法：选择rNPC和pNPC组织标本，应用Affymetrix Gene1.0 ST芯片，构建表达谱，检测两者之间的差异表达基因。结果 ：rNPC组与pNPC组比对，发现差异基因46个，下调基因38个，上调基因8个。这些基因参与钙结合、蛋白结合、酶活性调节等过程。结论：rNPC和pNPC之间存在基因差异表达，为了解rNPC的发生机制的研究起了一定的作用。

　　【关键词】 复发;鼻咽肿瘤;基因芯片;基因表达

　　Research on differentially expressed genes in primary and relapsed nasopharyngeal carcinoma by DNA microarray

　　HUANG Zhen-xiao，LI Wen-feng，DU Ji-mei，HUANG Ya，TAN Ying-xia，FANG Wei-qing， LIAO Zhi-su.

　　Department of Otolarygology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To study the differentially expressed genes between relapsed nasopharyn-geal carcinoma (rNPC) and primary nasopharyngeal carcinoma(pNPC)by the whole human genome gene chips. Methods: pNPC tissue samples and rNPC tissue samples were selected，and Affymetrix Gene1.0 ST chips were used to construct the expression profiling of each tissue sample. The differentially expressed genes were examined with bioinformatics. Results: A total of 46 genes was identified to be differential expressed in rNPC. Thirty eight genes were down-regulation，8 genes were up-regulation. These genes participated in the processes of calcium ion binding，protein binding，adjustment of enzyme activity genes and so on. Conclusion: The differentially expressed genes exist between pNPC and rNPC，it may play an important role in the mechanism of occurrence and development of rNPC.

　　Key words: relapsed;nasopharyngeal neoplasma;gene chips;gene exprssion

　　鼻咽癌是头颈部常见的鳞状细胞癌之一。它具有明显的区域分布特征：在亚洲人中常见，特别是中国南方和东南亚地区(患病率：15～50/100 000)[1]。目前，鼻咽癌的发生机制尚未明确。它的发病可能与环境因素、饮食，特别是EB病毒感染等因素有关[1-2]。近些年研究发现，大量的细胞增生功能通路在鼻咽癌中上调，比如Akt通路、有丝分裂原激活通路、Wnt通路及生长因子受体通路等[3]。遗传学和流行病学调查显示，HLA抗原单倍体HLA-2，HLA-B17，HLA-Bw26综合作用可以使鼻咽癌的发生风险增加两倍[4]。3号染色体长臂21区域的基因异常表达可能导致家族型鼻咽癌的发生[5]。

　　临床资料显示，经过放射治疗后，有10%～36%的鼻咽癌患者会出现鼻咽局部复发，其中65%～85%发生在治疗后的前3年内[6]。以往的研究主要针对鼻咽癌组织与正常或癌旁组织之间基因差异表达[7-8]，未见初发鼻咽癌与复发鼻咽癌之间基因差异的研究。本研究用基因芯片研究初发鼻咽与复发鼻咽癌之间的差异表达基因，可能为了解复发鼻咽癌的发生机制提供分子依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 芯片

　　全基因组寡核苷酸芯片Affymetrix Gene1.0ST芯片(GeneChip Gene 1.0ST)， 包含33 298个人类已知基因，含有17 000个基因探针。

　　1.2 仪器与试剂

　　RNA抽提试剂Trizol(invitrogen公司，美国)。Hybridization Control Kit，IVT Labeling Kit，One-Cycle cDNA Synthesis Kit，Streptavidin-Phycoerythrin，Gene array Scanner3000，Affymetrix Fluidics Station450，Affymetrix Genechip Hybridization Oven640，GCOS1.2均为美国affymetrix公司产品。

　　1.3 组织标本

　　本研究组织标本取自温州医学院附属第一医院耳鼻喉科，初发鼻咽癌组织8份，复发鼻咽癌组织6份，病理诊断均为鳞状细胞癌。标本取材后立即置液氮中保存。

　　1.4 总RNA的提取

　　先用匀浆器将组织彻底打碎，采用Trizol一步法提取总RNA。采用分光光度计分析RNA浓度和纯度，-80 ℃保存备用。

　　1.5 探针标记

　　两轮的cDNA链合成后，纯化cDNA后，将单链DNA片段化，然后进行标记。并检测标记效率。

　　1.6 杂交

　　使用全人类基因组Affymetrix Gene1.0ST芯片，在1.5 mL离心管中准备杂交液220μL，后混匀、离心。使用前室温平衡Gene 1.0芯片，加200μL杂交液，Affymetrix Genechip Hybridization Oven640杂交。

　　1.7 洗涤，扫描

　　SAPE染色液和抗体溶液各600μL，Affymetrix Fluidics Station450洗涤。

　　1.8 荧光扫描与结果分析

　　Gene array Scan-ner3000进行扫描，对芯片图像进行分析，图像信号转化为数字信号， 并对芯片上的数据方法进行归一。然后使用数据处理软件GCOS1.2进行数据分析。

　　1.9 差异表达基因的选择

　　复发鼻咽癌和初发鼻咽癌两张杂交膜中相同点的信号强度进行比较后得出该基因的信号比值，这一比值>2的为差异表达基因。

　　2 结果

　　2.1 总RNA提取结果

　　复发鼻咽癌组织和初发鼻咽癌组织提取的总RNA进行分光光度计分析RNA浓度和纯度(见图1)。

　　2.2 基因芯片筛选结果

　　复发鼻咽癌组织与初发鼻咽癌组织对比，差异表达基因总共46个，下调基因38个，上调基因8个。下调最高比值为12.50，上调最高比值为2.86。其中下调2～3倍的差异基因24个(见表1)，下调4～7倍的差异基因10个(见表2)，下调8倍的差异基因4个(见表3)。上调≥2倍的差异基因8个(见表4)，其中3个基因功能未知。

　　3 讨论

　　目前肿瘤复发的机制尚未明确，据推测它可能涉及抑癌基因、癌基因、转移相关基因、生长因子及其受体、黏附分子及细胞外基质、肿瘤血管及机体免疫等多个环节。鼻咽癌与其他头颈部鳞状细胞癌的不同之处是它的肿瘤复发发生较晚[9]，其复发的分子机制也可能涉及以上几个方面。

　　基因芯片又称cDNA微阵列技术，它含有大量已知的固定载体上的DNA片段序列，形成DNA微矩阵。将样品RNA通过体外逆转录、扩增后加入标记分子后，并与位于微阵列载体上的已知序列杂交，通过激光共聚焦检测系统对芯片扫描，检测杂交信号，计算机对数据进行综合分析后，即可获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。

　　目前，基因芯片已应用于鼻咽癌的相关基因筛选。它可以从整体基因组水平研究鼻咽癌中的基因改变，可能为了解鼻咽癌的发病机制提供大量信息。韩慧霞等[10]用基因表达谱芯片研究不同鼻咽组织间的存在大量差异表达基因，从而筛选出DBCCR1，GG2-1，SCC-S2，AZGP1等可能与鼻咽癌相关的基因。Liu等[11]类似的研究发现127差异表达基因，并筛选出E2F6，CTPS，SPAN-1，DSG3等基因。Sriuranpong等[12]应用基因芯片和激光捕获显微切割技术发现鼻咽癌组织和正常鼻咽上皮之间的存在650个差异表达基因。本研究应用Affymetrix Gene1.0ST芯片建立初发鼻咽和复发鼻咽的表达谱，通过两者之间比较，发现46个差异基因在复发鼻咽癌组织中表达。通过GO分类和Pathways分析，它们参与钙结合、核酸结合、蛋白结合，金属等多种酶活性等过程。

　　在肿瘤发生过程中，抑癌基因失活或癌基因的激活扮演着重要的角色。本研究发现抑癌基因：SERPINF1[serpin peptidase inhibitor， clade F (alpha-2 antiplasmin， pigment epi-thelium derived factor)，member 1]，为丝氨酸蛋白酶抑制超家族成员之一，具有抑制丝氨酸蛋白酶的作用。Ho等[13]发现SERPINF1具有拮抗血管生长因子作用，抑制脐静脉内皮细胞生长。它能诱导P53基因的过度表达，并通过过氧化物酶体增殖子活化受体γ信号通路(PPAR gamma signaling)来诱导脐静脉内皮细胞发生凋亡。DFNA5(deafness，autosomal dominant 5)是在胎儿耳蜗中发现的，主要功能可能跟听力减退等有关，但是仍不是很明确，但研究结果提示它可能是一个抑癌基因。Kim等[14]应用DNA微阵列技术研究结肠癌组织与正常结肠组织基因差异，发现DFNA5 mRNA在结肠癌中表达水平降低，并发现它的调控启动子甲基化率较高，故认为DFNA5是一个新的抑癌基因和人类肿瘤的分子标记。RASSF6(Ras association domain family mem-ber 6)为RAS联合区域家族中的一员，是一种抑癌基因，调节癌基因RAS的活动。Ikeda等[15]通过在宫颈Hela细胞中提高RASSF6的表达水平，结果导致细胞凋亡。它激活了Bax和促进细胞色素C(cytochrome C)释放，同样也激活了细胞凋亡蛋白酶3。但是细胞凋亡蛋白的阻滞剂Z-VAD-FMK没能阻止RASSF6介导的凋亡，说明RASSF6在依靠或不依靠细胞凋亡蛋白酶3的作用下，都可以导致细胞凋亡。FBLN1(fibulin 1)是纤维状的细胞外基质，由分泌的糖蛋白组成，是一种抑癌基因，它具有钙离子粘合作用和调节血小板的黏附作用。Cheng等[16]发现FBLN1在所有实验胃癌细胞株中均为表达下调，使得诱导胃癌前病变细胞凋亡的作用减弱，可能导致了胃癌的发生。以上几个基因，主要涉及抑癌作用，提示抑癌基因可能参与了鼻咽癌复发的生物学过程。

　　总之，在复发鼻咽癌中下调的差异表达基因比上调的要多。这些基因的功能需要进一步研究。基因芯片可以高通量、快速、有效地来大规模研究复发鼻咽癌和初发鼻咽癌之间的基因差异，为研究鼻咽癌复发机制提供了大量的信息。

　　【参考文献】

　　[1]Hildesheim A, Levine PH. Etiology of nasopharyngealcarcinoma: a review[J]. Epidemiol Rev,1993,15(2):466-485.

　　[2]Chien G, Yuen PW, Kwong D, et al. Comparative genomichybridization analysis of nasopharygeal carcinoma: consis-tent patterns of genetic aberrations and clinicopathologicalcorrelations[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2001,126(1):63-67.

　　[3]Chou J, Lin YC, Kim J, et al. Nasopharyngeal carcinoma-review of the molecular mechanisms of tumorigenesis[J].Head & Neck,2008,30(7):946-63.

　　[4]Zhou X, Cui J, Macias V, et al. The progress on geneticanalysis of nasopharyngeal carcinoma[J].Comp FunctGenomics,2007:57513.

　　[5]Xiong W, Zeng ZY, Xia JH, et al: A susceptibility locus atchromosome 3p21 linked to familial nasopharyngealcarcinoma[J]. Cancer Res, 2004, 64(6):1972-1974.

　　[6]卢泰祥,韩非,李嘉欣. 复发鼻咽癌临床研究进展[J].中国癌症杂志,2008,9(18):661-666.

　　[7]Guo X, Lui WO, Qian CN, et al. Identifying cancer-relatedgenes in nasopharyngeal carcinoma cell lines using DNA andmRNA expression profiling analyses[J]. Int J Oncol, 2002,21(6):1972-1204.

　　[8]李瑞平,邵建永,邓玲,等. 用原代细胞培养和人全基因表达谱芯片筛选鼻咽癌差异表达基因[J]. 南方医科大学学报,2007,27(8):1156-1160.

　　[9]Hwang JM, Fu KK, Phillips TL. Results and prognostic fac-tors in the retreatment of locally recurrent nasopharyngealcarcinoma[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys ,1998,41(5):1099-1111.

　　[10]韩慧霞,姚连生,王爽，等. 人鼻咽癌不同部位组织相关基因表达谱的研究[J]. 第一军医大学学报, 2004,24(10):1126-1129.

　　[11]Liu ZQ, Tian YQ, Hu YF, et al. Alteration of gene expres-sion during nasopharyngeal carcinogenesis revealed by oli-gonucleotide microarray after microdissection of tumor tis-sue and normal epithelia from nasopharynx[J]. ChineseMedical Journal, 2009, 122(4):437-443.

　　[12]Sriuranpong V, Mutirangura A, Gillespie JW, et al. Globalgene expression profile of nasopharyngeal carcinoma bylaser capture microdissection and complementary DNAmicroarrays[J]. Clin Cancer Res, 2004,10(15):4944-4958.

　　[13]Ho TC, Chen SL, Yang YC, et al. PEDF induces p53-medi-ated apoptosis through PPAR gamma signaling in humanumbilical vein endothelial cells[J]. Cardiovasc Res,2007 ,76(2):213-223.

　　[14]Kim MS, Chang X, Yamashita K ,et al. Aberrant promotermethylation and tumor suppressive activity of the DFNA5gene in colorectal carcinoma[J]. Oncogene,2008,27(25):3624-3634.

　　[15]Ikeda M, Hirabayashi S, Fujiwara N ,et al. Ras-associationdomain family protein 6 induces apoptosis via both caspase-dependent and caspase-independent pathways[J]. Exp CellRes,2007,313(7):1484-1495.

　　[16]Heng YY, Jin H, Liu X ,et al. Fibulin 1 is downregulated throughpromoter hypermethylation in gastric cancer[J]. Br J Cancer,2008,99(12):2083-2097.