药物性聋和非综合征性聋相关的线粒体DNA C1494T突变对细胞功能的影响

作者：赵辉　严庆丰    作者单位：中国人民解放军总医院耳鼻咽喉研究所（北京　100853） 【摘要】  目的　通过细胞学方法，分析药物性聋和非综合征性聋相关的线粒体DNA C1494T突变对细胞功能的影响。方法　将从携带C1494T突变的中国家系成员的淋巴细胞中的线粒体分别转移到线粒体DNA缺乏的 ?籽0206细胞中，分别形成融合细胞系，然后对耳聋相关的线粒体12S rRNA C1494T突变进行生化特性的研究。其中，来自2名听力正常者的6个融合细胞系，来自听力下降者的9个融合细胞系，均有线粒体DNA C1494T突变。结果　来自听力下降者的融合细胞系的线粒体DNA标记速率分别比对照组4名成员的12个融合细胞系下降了38％ 和43％，这一缺陷显然造成了携带C1494T突变的融合细胞（不论来自听力正常者还是来自听力下降者）的细胞总体呼吸率下降，或苹果酸/谷氨酸、琥珀酸/3-磷酸甘油及TMPD/抗坏血酸所始动的呼吸率下降。而且，和对照组的细胞系相比，有C1494T突变的听力正常者或听力下降者的融合细胞系在含有（或不含）高浓度巴龙霉素的DMEM培养液中，细胞倍增时间有非常显著的一致增加。结论　我们的试验结果首次以直接的生化学证据证明：线粒体12S rRNA的A位点是氨基糖甙类药物性聋的主要作用位点；而且细胞核背景在线粒体DNA 12S rRNA C1494T突变导致的非综合征性聋和氨基糖甙类耳毒性的发病中起着关键性的作用。　　

【关键词】  聋 细胞功能 线粒体DNA（mtDNA）

　　Functional characterization of the mitochondrial 12S rRNA C1494T mutation associated with aminoglycoside-induced and　 non-syndromic hearing loss

　　ZHAO Hui, YAN Qing-feng, LI Rong-hua, CAO Ju-yang, WANG Qiu-ju, LI Xiao-ming, Jennifer L. PＥＴＥＲＳ, HAN Dong-yi, YANG Wei-Yan, GUAN Min-Xin

　　1　Institute of Otolaryngology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China

　　2　Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Division of Human Genetics, Cincinnat, OH 45229, USA　Corresponding author: YANG Wei-yan and GUAN Min-Xin　　　　【Abstract】 Objective　To analysis biochemical characterization of the deafness-associated mitochondrial 12S rRNA C1494T mutation. Methods　We examined the biochemical characterization of the deafness-associated mitochondrial 　12S rRNA C1494T mutation using 27 cybrid cell lines constructed by transferring mitochondria from 9 lymphoblastoid cell lines derived from a Chinese family into human mitochondrial DNA（mtDNA）-less（ ρ0206） cells. Results　Six cybrids derived from two asymptomatic members, and nine cybrids derived from three symptomatic members of the Chinese family carrying the C1494T mutation exhibited 38 and 43% decrease in the rate of mitochondrial protein labeling, respectively, compared with twelve cybrids derived from four Chinese control individuals. These defects are apparently a primary contributor to significant reductions in the rate of overall respiratory capacity or the rate of malate/glutamate promoted respiration, or succinate/G3P-promoted respiration, or TMPD/ascorbate-promoted respiration in mutant cybrid cell lines derived from either symptomatic or asymptomatic individuals. Furthermore, the very significant/nearly identical increase in the ratio of doubling times in DMDM medium in the presence/absence of high concentration of paromomycin was observed in symptomatic or asymptomatic cybrid cell lines carrying the C1494T mutation as compared with the average rate in control cell lines. Conclusion　Our data strongly support the idea that the A site of mitochondrial 12S rRNA is the primary target for aminoglycoside-induced deafness. In addition, these data provide the first biochemical evidence that nuclear background plays a critical role in the phenotypic manifestation of nonsyndromic hearing loss and aminoglycoside toxicity associated with the C1494T mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene.　　　　【Key words】　Deafness;　Cell functional characterization;　Mitochondrial DNA (mtDNA)　　　　已经发现线粒体DNA（mtDNA）突变与综合征性聋和非综合征性聋有关［1, 2］，线粒体tRNASer（UCN）是与非综合征性聋有关的线粒体突变热点，在此  基因上已经定位了4个耳聋相关突变位点： A7445G ［3, 4］、7472insC［5, 6］、T7510C［7, 8］和 T7511C［9, 10］。12S rRNA是氨基糖甙类药物性聋和非综合征性聋的有关的另一个线粒体DNA突变热点。已经在不同种族的多个家系中发现位于该基因的同质性A1555G突变，该突变位于12S rRNA的高度保守的编码区域，与氨基糖甙类药物性聋和非综合征性聋有关［11-18］，另外还有氨基糖甙类药物性聋和非综合征性聋相关的12S rRNA的961位点突变的报道［19-22］，近期还发现12S rRNA T1095C突变也与耳聋有关［23, 24］。我们已经报道了一个与氨基糖甙类药物性聋和非综合征性聋有关的同质性C1494T突变，该突变也位于mtDNA 12S rRNA的高度保守的编码区域［25］。如图1所示，C1494T突变位于线粒体小核糖体亚单位的编码区域［26］，其序列从细菌到哺乳动物是高度保守的［27］，该区域对于氨基糖甙类药物的作用非常重要［28, 29］。当发生C1494T突变时，可以形成新的1494U-A1555碱基配对，这和12S rRNA 的A1555G突变造成的1494C-G1555碱基配对在结构上相似［25］。研究表明：由C1494T或A1555G突变所形成新的U-A或G-C碱基配对可以使线粒体DNA与氨基糖甙类药物的结合更加容易［30, 31］。而临床研究也发现携带这些突变的个体接受氨基糖甙类药物后，可以造成听力下降或原有的听力下降程度加重［11, 25, 32］。在前面的研究中发现（图2）：当没有接受氨基糖甙类药物时，携带C1494T突变的中国家系中的母系成员表现为非综合征性感音神经性聋，其临床表现可以是从正常听力到轻度听力下降，甚至发生重度耳聋，其发病年龄的差距也很 大［25］。为了对C1494T突变的发病机制进行深入探讨，同时也为了了解细胞核背景对该线粒体C1494T突变后果的调控作用，我们分别把来源于该中国家系的3名听力下降母系成员和2名听力正常母系成员的淋巴细胞系中的线粒体转移到人类线粒体DNA缺乏细胞－ ?籽0206细胞，构成相应的携带C1494T突变的融合细胞系［33, 34］。首先检测这些融合细胞系C1494T突变外显率和表达水平，以确认细胞融合成功。然后就线粒体蛋白合成率、内生氧呼吸率和底物依赖性呼吸率及氨基糖甙类药物敏感性对这些融合细胞进行检测，以分析C1494T突变对细胞功能的影响。

　　1　材料和方法

　　1.1　细胞系和培养条件

　　永生淋巴细胞系分别来自家系中5位成员（ⅠⅡ-14、Ⅲ-16听力正常（AS组）；Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28听力下降（S组））和4位汉族正常对照者（A3、A6、A7和A8（C组））。以RPMI 1640培养液（Invitrogen公司）加10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）培养淋巴细胞。源于阿拉伯－以色列家系的A1555G突变融合细胞系－F7H［35］和溴脱氧尿苷（bromodeoxyuridine, BrdU）耐受的骨肉瘤143B.TK-细胞需要在加入5%胎牛血清和100 μg的溴脱氧尿苷DMEM（Dubeeco Modified Eagle’s Medium）培养液（Invitrogen公司）中培养。缺乏线粒体DNA的 ?籽0206细胞来源于143B.TK-细胞，除了需要在培养液额外增加50  μg/ml的尿嘧啶（uridine）外，其他的培养条件与143B.TK-细胞相同。所有由去核淋巴细胞构建的转线粒体细胞都按照143B.TK-细胞的培养条件进行培养。　　　　为了检测不同细胞系对巴龙霉素的敏感性，将定量的105细胞加入10%胎牛血清的DMEM（Invitrogen公司）培养液中，分别加入或不加入巴龙霉素（2 mg/ml）进行培养。细胞倍增时间（DT）可以根据生长曲线或根据公式DT =（t-t0）lg2/（lgN-lgN0）计算，在公式中，t和t0指细胞计数的时间，N和N0分别指在时间t和t0的细胞计数。

　　１.２　转线粒体细胞的培养和筛选

　　淋巴细胞系分别来自家系中5位成员（Ⅲ-14、Ⅲ-16听力正常（AS组）；Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28听力下降（S组））和4位汉族正常对照者（A3、A6、A7和A8（C组））［25］。按照King和Attardi方法建立转线粒体细胞系：首先在硝酸纤维素离心管内依次加入2 ml 25%、 2 ml 17%、 0.5 ml 16%、0.5 ml 15%和2ml 12.5%的Ficoll，使之形成梯度胶。然后将Ficoll溶解在含有细胞松弛素B（cytochalasin B）和5%胎牛血清的DMEM培养液中，Ficoll的终浓度为12.5%。分别从以上突变组和对照组的淋巴细胞系中取5 × 107的淋巴细胞，离心后重新悬浮于5 ml 上述溶液中。将细胞分别加入相应的离心管中以25 000 r/min离心60分钟。离心后可以发现供体细胞的胞质位于14%和16%的Ficoll的交界面，形成两层，而细胞核位于17%和25%的Ficoll交界面。将胞质层收集并悬浮到胞质液（DMEM ＋ 20% 胎牛血清 ＋ 50 g/ml尿嘧啶）中， 1 000 r/min离心5分钟，用2 ml胞质液将其重新悬浮。混悬液放入37℃培养箱孵育30分钟以使细胞质恢复成球形。　　　　胞质混悬液和1 × 106 ?籽0206细胞轻柔混合后离心，然后在40%聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）溶液中重新悬浮，常温1分钟后以加入10%胎牛血清和50 g/ml尿嘧啶（uridine）的DMEM培养液稀释后孵育，然后以加入5%精练胎牛血清和50 g/ml BrdU的DMEM培养液进行培养和筛选，最终从含有单个克隆的培养皿内分离出状态稳定的融合细胞系［33-35, 37, 38］。

　　1.3　线粒体DNA分析

　　按照Rieder MJ［47］所描述的引物、PCR条件和测序分析方法检测C1494T突变的外显率和表达水平，按照slot-blot 杂交法［36］检测不同融合细胞的mtDNA拷贝数。

　　１.４　线粒体蛋白合成分析

　　在吐根素（emetine）存在时，在不含甲硫氨酸的DMEM培养液中加入［35S］甲硫氨酸－［35S］半胱氨酸，脉冲标记突变组和对照组细胞系30分钟，对其翻译产物进行蛋白定量，每个样品加样20μg，以聚丙烯酰胺梯度胶进行电泳，并对全部电泳条带进行放射性定量分析［36, 37, 39, 40］。

　　1.5　测量氧消耗率

　　在特制的无葡萄糖DMEM培养液中加入10% 透析过的胎牛血清，然后向其中加入5 × 106贴壁细胞或者1 × 107淋巴细胞，总体积为1.8ml，通过YSI 5300氧分析仪（Yellow Springs Instruments公司）测量完整细胞的氧消耗率。应用不同的呼吸作用的底物和抑制剂以测量呼吸链中不同复合体的活性［41］。

　　1.6　计算机分析

　　利用微软的Excel软件（version 5，支持Macintosh系统）对不同变量进行Student's t-test，利用CA-Cricket Graph ⅢTM程序（version 1.5.2，支持Macintosh系统）进行相关－回归分析。

　　2　结　果

　　2.1　融合细胞系的构建

　　淋巴细胞系分别来自家系中5位成员 —— Ⅲ-14、Ⅲ-16听力正常（AS组），Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28听力下降（S组）—— 和4位年龄在20 ～ 40岁的汉族正常对照者 —— A3、A6、A7和A8（C组）。将淋巴细胞去核化，然后在含有大量的人类线粒体缺乏DNA细胞－ ?籽0206细胞的环境中进行细胞融合，将融合的混合细胞在含有BrdU而     缺乏尿嘧啶的选择性DMEM培养液中进行培养［34, 35, 37, 38］，在融合后的25 ～ 45天内，每个不同的供体细胞系可以分离出10 ～ 15个可能的线粒体融合细胞株，对这些细胞株的C1494T外显率和表达水平进行分析［25］，在对照组的融合细胞系中没有发现C1494T突变，而突变组的融合细胞均有同质性C1494T突变，表明线粒体转移成功。以地高辛（DIG）标记的标准化mtDNA 12S rRNA和核28S rRNA探针［36, 37］进行slot-blot杂交，以分析融合细胞中的mtDNA拷贝量。每个供体淋巴细胞系形成若干个融合细胞株，从中选择mtDNA拷贝数相同的3个融合细胞株进行传代培养，用于下面一系列的细胞生化功能分析试验。

　　2.2　融合细胞系的线粒体蛋白合成缺陷

　　为了分析携带C1494T突变的融合细胞线粒体蛋白翻译缺陷，4个对照者和中国家系的5位成员 ——Ⅲ-14、Ⅲ-16听力正常（AS组），Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28听力下降（S组），每个供体细胞分离出3个融合细胞。培养液中含有100 μg/ml吐根素（emetine）时可以抑制细胞质蛋白合成而不影响线粒体的蛋白合成［39］。以［35S］甲硫氨酸－［35S］半胱氨酸在不含甲硫氨酸的DMEM培养液中脉冲标记细胞系30分钟，使线粒体可以利用这些有放射性标记的氨基酸合成蛋白。突变组和对照组融合细胞系的线粒体翻译产物的典型电泳条带图如图3所示。对C1494T突变的融合细胞mtDNA所编码的多肽进行分别定量，以计算不同多肽的电泳迁移率，将其与对照组融合细胞和143B.TK-细胞进行比较（图3A、 B）。可以看出，与对照组融合细胞相比，携带C1494T突变的融合细胞的线粒体翻译产物标记总量呈明显的下降趋势。

　　我们进行了多次的蛋白合成标记和电泳试验，对梯度胶板进行荧光显像，对显像曝光密度量化后进行定量分析，并且所有胶板的各个样品的显像曝光密度均与相应胶板中的143B.TK-细胞的显像曝光密度进行标准化比较，其结果如图4所示。可见听力下降成员（Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28）来源的突变组（S组）融合细胞的线粒体翻译产物的标记总量较对照组细胞系（C组）下降37 ～ 48%，平均下降43%（P = 0.0006）。同样，从家系听力正常者（Ⅲ-14、Ⅲ-16）获得的突变组融合细胞系（AS组）线粒体翻译产物的标记总量比对照组细胞系（C组）下降34 ～ 43%，平均下降38%（P = 0.0197）。在此图中我们可以看到：携带C1494T突变的所有融合细胞系（AS组和S组）的线粒体蛋白标记水平较携带A1555G突变的F7H融合细胞系平均下降了35%。

　　2.3　融合细胞的呼吸缺陷

　　上述的每个对照者和携带C1494T突变的家系成员分离出3个融合细胞系，测量其完整细胞的氧消耗率，对其内生呼吸率进行分析［33］，结果如图5所示，从听力下降者（Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28）分离出来的携带C1494T突变的融合细胞系（S组），与对照组相比较，其总氧消耗率下降程度自35% 至47%不等，平均下降41%（P = 0.0017）。同样，从家系听力正常者（Ⅲ-14、Ⅲ-16）获得的突变组的融合细胞系（AS组），总氧消耗率较对照组的下降程度自33% 至37%不等，平均下降35%（P = 0.0095）。不论AS组还是S组，与对照组融合细胞系相比，其总氧消耗率的改变大体相似。而且氧消耗率与线粒体蛋白合成的标记总量显示出非常显著的相关性（r = 0.98，P < 0.001; r = 0.99，P < 0.001）。

　　为了分析突变组细胞系中呼吸链的酶复合体对细胞功能的作用，在洋地黄皂甙极化的细胞中应用不同底物和抑制剂［41］进行了氧消耗率检测。结果如图6所示：在从听力下降者（Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28）分离出来的携带C1494T突变的融合细胞系（S组）的苹果酸（malate）/谷氨酸（glutamate）所始动的呼吸率显著下降，分别比对照组融合细胞系（C组）降低了39% ～ 51%（平均下降44%，P  = 0.0004）。此呼吸率依赖于NADH辅酶Q氧化还原酶（复合体Ⅰ）、辅酶－细胞色素c还原酶（复合体Ⅲ）和细胞色素c氧化酶（复合体Ⅳ），但是通常受复合体Ⅰ的活性速率的限制［41, 42］。琥珀酸（succinate）/3-磷酸甘油（G3P）始动的呼吸率依赖于复合体Ⅲ和Ⅳ的活性，但是通常受复合体Ⅲ的活性速率的限制，在来源于听力下降者的融合细胞系（S组）的相应呼吸率比对照组融合细胞系（C组）分别下降了34%～50%（平均下降41%，P = 0.0021）。由N，N，N′，N′-四甲基-对-苯二胺（N，N， N′， N′- tetramethyl-p-phenylenediamin，简称TMPD）/抗坏血酸始动的呼吸率反映了复合体Ⅳ的活性，该呼吸率在S组融合细胞系比C组融合细胞系分别下降了32% ～ 44%（平均下降37%，P = 0.0012）。从听力正常的家系成员来源的融合细胞系（AS组）的相应呼吸率也分别比对照组融合细胞系有所下降，只是较S组融合细胞系的下降程度稍轻一些，苹果酸/谷氨酸始动的呼吸率下降了36% ～ 43%，平均下降39%（P = 0.0044）；琥珀酸/三磷酸甘油始动的呼吸率下降了29% ～39%，平均下降34%（P = 0.0263）；TMPD/抗坏血酸始动的呼吸率下降28% ～ 30%，平均下降29%（P = 0.0023）。S组融合细胞系与C组融合细胞系相比，苹果酸/谷氨酸、琥珀酸/三磷酸甘油和TMPD/抗坏血酸始动的呼吸率的变化与线粒体蛋白合成标记总率的相应变化呈显著相关性（分别为r = 0.98，P < 0.001；r = 0.97，P < 0.001；r = 0.98，P < 0.001）。同样，AS组融合细胞系与C组融合细胞系相比，上述呼吸率的变化与线粒体蛋白合成标记总率的相应变化也呈显著相关性（分别为r = 0.99，P < 0.001；r = 0.98，P < 0.001；r = 0.98，P < 0.001）。

　　2.4　氨基糖甙类药物对细胞生长的影响

　　氨基糖甙类药物对细胞生长有一定的影响。为了分析C1494T突变在其中的作用，4个对照者、携带C1494T突变的中国家系的5位成员（Ⅲ-14、Ⅲ-16，听力正常；Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28，听力下降），每个供体细胞分离出3个融合细胞系，将融合细胞系在加入/不加入氨基糖甙类药物（2 mg/ml巴龙霉素）的DMEM培养液中培养4天。结果如图7所示：在巴龙霉素存在时，与对照组细胞相比，携带C1494T突变的融合细胞系显示出具有统计学显著性的、一致的细胞生长速度下降。特别是携带C1494T突变的细胞在有（或无）巴龙霉素时的细胞倍增时间比值（ratio of DT）分别比对照组融合细胞增加了29% ～ 33%（平均30.5%，P < 0.0001)）。携带C1494T突变的融合细胞系的细胞倍增时间比值与携带A1555G突变的来源于F7H的融合细胞的细胞倍增时间比值相似。从这些数据可以说明：从中国家系母系成员分离出的携带C1494T突变的融合细胞系对氨基糖甙类药物敏感，C1494T突变对氨基糖甙类药物的作用起着关键作用。

　　3　讨　论

　　在本试验中，我们利用人类骨肉瘤细胞融合　技术，分析了中国大家系中耳聋相关的线粒体12S rRNA C1494T突变的致病机制，当细胞核背景相同时，不论来自中国大家系中听力正常成员还是来自听力下降成员，携带C1494T突变的融合细胞系的线粒体功能障碍程度近乎相同，特别是其线粒体蛋白合成率有非常显著的降低，这更加清楚地说明了C1494T突变是导致线粒体蛋白合成障碍的主要因素。而且在各个不同的融合细胞系中，线粒体蛋白合成率与细胞总呼吸能力之间或者与苹果酸/谷氨酸、琥珀酸/3-磷酸甘油（G3P）或者与TMPD/抗坏血酸始动的各个亚单位的呼吸率之间均有非常显著的相关性。C1494T突变可以造成线粒体蛋白合成下降大约40%，这应该可以造成细胞呼吸能力的显著下降。来源于阿拉伯－以色列家系母系成员、携带A1555G突变的融合细胞的线粒体蛋白标记率下降35％ ～ 37%，与携带C1494T突变的融合细胞的下降程度接近［35］。但是， 根据以前文献， A1555G突变致聋的阈值大概是在线粒体蛋白合成率下降50%［36］；同样，慢性外眼肌麻痹［43］或Pearson综合征［44］时，线粒体DNA发生了包括tRNA基因在内的大约5 kb的缺失，其DNA拷贝数减少50% ～ 60%以上； 伴有破碎红纤维的肌阵挛性癫痫（myoclonic epilepsy and ragged-red fiber disease, MERRF）时线粒体A8344G突变，使tRNALys相关的氨基酰化能力下降了50％ ～ 60%［45］， 这几种线粒体DNA的改变均造成线粒体翻译率和呼吸能力的显著下降，其阈值也大约在此范围。携带C1494T突变的融合细胞系的线粒体蛋白合成率受影响的程度尚不能达到此阈值，因此其表型可能是正常的［36］。在本试验中，突变组融合细胞的轻度生化缺陷可以解释为什么只有一部分携带C1494T突变的个体产生耳聋［25］， 即单纯的C1494T突变不足以产生临床表型，而核修饰基因等其他因素对C1494T突变的表型有调控作用。

　　已经发现了C1494T突变可以造成氨基糖甙类药物的超敏性［25］，而在DMEM培养液中有（或无）高浓度巴龙霉素存在时，与对照组相比，携带C1494T突变的中国家系的5位成员（Ⅲ-14、Ⅲ-16，听力正常；Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28听力下降）的融合细胞系的细胞倍增时间比呈一致性的显著增加。同样携带C1494T突变，来源于Ⅲ-14、Ⅲ-16（听力正常者）与Ⅲ-12、Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28（听力下降者）的各个淋巴细胞系的氨基糖甙类药物敏感性有相当明显的差异［25］。此部分试验的结果与之不同，当培养液中含有巴龙霉素时，携带C1494T突变的融合细胞生长率的降低，主要原因是线粒体翻译率的降低，并造成继发的呼吸障碍，这与A1555G突变时细胞的改变相类似［18， 32］。携带C1494T突变的Ⅲ-14、Ⅲ-16（听力正常）与Ⅲ-12、Ⅲ-18、Ⅳ-21和Ⅳ-28（听力下降）等母系成员的淋巴细胞系的细胞核背景不同，其对氨基糖甙类药物的敏感程度也不尽相同，在此部分试验中，我们把其线粒体转移融合至相同细胞核背景的线粒体缺乏DNA细胞，发现不同来源的融合细胞系对氨基糖甙类药物敏感性的差距显著缩小了，这也是首次以直接的生化证据证明细胞核背景在C1494T突变相关的氨基糖甙类耳毒性中起着关键作用。这些结果还表明，当细胞核背景相同时，融合细胞的氨基糖甙类药物敏感性完全依赖于线粒体12S rRNA C1494T突变。　　　　表1列出了携带A1555G和C1494T突变的融合细胞的氨基糖甙类药物敏感性和线粒体功能障碍的程度，其中A1555G突变细胞的数据来自管敏鑫等的资料［35］。从中可以发现：携带A1555G突变的阿拉伯－以色列家系中的5名听力下降者和3名听力正常者分离出来的融合细胞系，线粒体蛋白标记率呈一致性显著下降。在本试验中，同样可以观察到：携带C1494T突变的中国家系中3名听力下降者和2名听力正常者分离出的融合细胞系，其线粒体蛋白标记率也呈近乎一致性的显著下降。对携带A1555G突变和C1494T突变的融合细胞的其他一些参数一一进行比较后可以看出，与对照组相比，两个突变造成的线粒体功能障碍和氨基糖甙类药物敏感性的改变的程度和趋势非常相似。根据我们的试验结果，足以有效地证明C1494T突变是一个与氨基糖甙类药物性聋和非综合征性聋相关的全新的致病性的线粒体DNA突变。　　　　总之，根据对携带C1494T突变的融合细胞系进行的相关试验，发现C1494T突变造成了线粒体蛋白合成率的显著下降可能是突变细胞呼吸率异常的主要致病因素，而且由此导致耳蜗细胞的维持正常听功能的ATP生成减少，这可能也是细胞氧化磷酸化异常和氨基糖甙类毒性的致病机制。但是在此中国家系中，我们也观察到其C1494T突变的外显率为不完全性［46］，结合其轻度的生化缺陷，可以认为：单独的C1494T突变本身可能不足以产生听力障碍表型，氨基糖甙类药物对其表型有促进或诱导作用，而细胞核背景在C1494T突变相关的非综合征性聋和氨基糖甙类药物性聋的发病中起着关键作用。

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