甲磺酸去铁胺抗丁胺卡那霉素耳毒性作用及机理研究

作者：李虹　纪旭　姜学钧    作者单位：中国医科大学附属第四医院耳鼻咽喉科（沈阳　110032） 【摘要】  目的　验证铁离子螯合剂甲磺酸去铁胺（deferoxamine mesylate，DFO）抗丁胺卡那霉素耳毒性作用及其机理研究。方法　豚鼠随机分为丁胺卡那霉素组（卡那组）、DFO + 丁胺卡那霉素组（卡那 + DFO组）、对照组，每组8只动物，采用畸变产物耳声发射（DPOAE）、耳蜗铺片及透射电镜、扫描电镜技术，观察用药前后功能和形态学的改变，检测血清中总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）以及丙二醛（MDA）的活力。结果　卡那组与卡那 + DFO组的DPOAE的幅值有显著性差异（P < 0.01），形态学改变与听力改变相平行。DFO组血清中的T-SOD和GSH-PX的活力明显高于卡那组（P < 0.05），卡那 + DFO组血清中MDA的活力明显低于卡那组（P < 0.05）。结论　DFO能有效的保护耳蜗免受丁胺卡那霉素的耳毒性侵害，保护作用与自由基 相关。

【关键词】  丁胺卡那霉素 去铁胺 耳毒性 药物相互作用

　　Deferoxamine protects against amikacin ototoxicity and ist mechanism

　　LI  Hong, JI Xu, JIANG Xue-jun

　　1　Department of Otorhinolaryngology, Fouth Affiliated Hospital of China Medical University, graduated as a Master of Otorhinolaryngology from First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang, China

　　2　Department of Otorhinolaryngology, First Affiliated Hospital of China Medical University Shenyang, China

　　【Abstract】 Objective　To study the preventin of amikacin ototoxicity by use of deferoxamine （DFO） in guinea pigs. Methods　Guinea pigs were randomly assigned to one of three groups: amikacin-treated alone, amikacin and DFO in combination and a control group. Distortion product acoustic emission （DPOAE）, surface preparation technique and transmission and scanning electron microscopy were utilized to evaluate the auditory founction and the cochlear morphology. To explore the mechanism associated with deferoxamie protection, serum activities of T-SOD, GSH-PX and MDA were measured. Results　The DPOAE amplitudes of the DFO group and the amikacin group were significantly different（P  < 0.01）. Morphological changes  were consistent with founctional changes. Serum activity of T-SOD and GSH-PX in the DFO group was much higher than that in the amikacin group（P < 0.05）, while the serum activity of MDA in the DFO group was significantly lower than that in the amikacin group（P < 0.05）. Conclusion　This study suggests that DFO can reduce amikacin ototoxicity effectively, and the protection mechanism is relevant to free radical scavenging.

　　【Key words】　Amikacin;　Deferoxamine;　Ototoxicity;　Drug interactions

　　氨基糖甙类药物具有显著的耳毒性及肾毒性，这成为氨基糖甙类抗生素临床应用中必须密切注意和预防的问题。为了解开氨基糖甙类耳毒性及肾毒性之谜，国内外许多学者做了大量的临床和实验研究［1-3］。Pierson等［4］根据实验指出自由基清除剂 氨磷汀（amifostine，又称为WR-2721，化学名称是S’-2（3-氨基丙胺）乙基硫代磷酸酯）可有效地预防卡那霉素的耳毒性，并且提出卡那霉素的耳毒性与自由基有关。Priuska［5］等也提出庆大霉素（gentamicin，GM）等氨基糖甙类药物耳毒性可能是由于其在体内形成GM-铁复合物，其可催化体内自由基的产生，从而损伤耳蜗毛细胞。甲磺酸去铁胺（deferoxamine mesylate，DFO）是一种铁离子螯合剂，也竞争性地与铁离子形成复合物，因而减少铁与庆大霉素的结合从而减少了自由基的生成。临床上DFO常用于治疗输血所致的含铁血黄素沉着病和地中海贫血等急慢性铁中毒［6］。这种复合物通过胆汁和尿液可完全排泄，没有耳毒性及肾毒性等不良反应。大量的研究所用的耳毒性药物多为庆大霉素，而临床上另一种常应用的氨基糖甙类抗生素丁胺卡那霉素却较少涉及，本研究在建立丁胺卡那霉素耳毒性模型后，从功能和形态学两方面探讨DFO对丁胺卡那霉素耳毒性损伤是否有保护   作用。

　　1　材料及方法

　　1.1　实验动物分组及模型的制备　

　　耳廓反射正常的健康白毛赤目豚鼠共24只，体重350 ～ 400 g，由校动物部提供，动物运到后，饲养5天左右，以适应实验室的环境。之后随机分成3组。丁胺卡那霉素组8只（以下简称卡那组），丁胺卡那霉素（广东省中山市三才制药集团公司，批号：051105）400 mg/kg大腿内侧肌肉注射，每天1次，连续7天；DFO ＋ 丁胺卡那霉素组8只（以下简称卡那 ＋ DFO组），每天先腹腔注射DFO（Novartis Pharma Schweiz AG，瑞士，由诺华制药公司提供，批号：SL1330）150 mg/kg［7-9］，1小时后注射卡那霉素，剂量及给药方法同前，间隔4小时后，第二次注射DFO，剂量及给药方法同前，连续7天；对照组8只：生理盐水等量腹腔注射，每天1次。动物实验期间每天称体重以调整药量。

　　1.2　DPOAE检测豚鼠耳蜗受损状况　

　　用药前1天及停药第2天检测双耳DPOAE。动物在1% 戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉下，利用Ｓmart OAE耳声发射仪（美国Intelligent Hearing Systems公司） 检测双耳500 ～ 8 000 Hz的DPOAE听力图，以判断豚鼠耳蜗的损伤情况。测试时，热水袋保温，清除豚鼠外耳道周围耳毛，清除耵聍，检查外耳道及鼓膜。豚鼠头部固定，将耳塞置于外耳道口，使之与外耳道口密封。选择初始纯音f1和f2，使f2／f1=1.22，强度差L1 － L2 ＝ 10 dB SPL，DPOAE幅值超过本底噪声3 dB以上为检出标准，测试频率f0［f0 =（f1 × f2）/2］分别为0.5、1、2、4、8 kHz处的dB SPL幅值。

　　1.3　光镜观察耳蜗基底膜铺片　

　　停药后第2天，各组动物心脏灌流磷酸缓冲液（PBS）及2.5％ 戊二醛与4％多聚甲醛1：1配制而成的固定液后，断头处死，将每只动物两耳听泡取出置于2.5% 戊二醛内，解剖显微镜下摘除镫骨，刺破圆窗，挑开蜗顶后，灌流4％ 多聚甲醛固定液；将每只动物的左耳听泡再以0.5％ 硝酸银灌流染色，用蒸馏水冲洗后，置于2.5％ 戊二醛固定液中固定4小时以上后解剖标本，取出各回基底膜，在光镜（Olympus，型号：SZX12，日本）下铺片观察［10］。

　　1.4　透射及扫描电镜样品制备［11, 12］　

　　将所有动物的右耳听泡用PBS液冲洗，置于2.5％戊二醛固定液中浸泡后及时送至我校第二电镜室由专业人员帮助制备扫描及透射电镜样品。透射电镜标本的制备：取出基底膜后用磷酸缓冲液冲洗，四氧化锇固定，乙醇脱水，环氧树脂浸透包埋，半薄切片染色定位，超薄切片醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜（JEOL JEM-1200 EX，日本）下观察。扫描电镜标本的制备：揭除耳蜗盖膜，磷酸缓冲液冲洗，四氧化锇固定，磷酸缓冲液漂洗，置于单宁酸中30分钟两次，磷酸缓冲液漂洗，乙醇脱水，醋酸异戊脂过渡，离子溅射镀膜，扫描电镜（ＪＥＯＬ JSM-      T300，日本）下观察。

　　1.5　血清学指标的检测　

　　处死动物前取各只动物内眦血各3 ml，3 000 r/min离心10 min，取上清液，采用南京建成生物研究所生产的MDA（丙二醛）［13］、T-SOD（总超氧化物歧化酶）和GSH-PX（谷胱甘肽过氧化物酶）测定试剂盒，按说明（即MDA：硫代巴比妥酸比色法；T-SOD：黄嘌呤氧化酶法；GSH-PX：硫代二硝基苯甲酸法）操作检测各物质的活力，比较不同处理因素各物质活力是否有差别，统计学处理应用配对t检验和单因素方差分析。

　　2　结　果

　　2.1　DPOAE检测

　　用药前，三组动物各个频率之间相比无统计学差异。用药7日后，三组动物除500 Hz处DPOAE的dB SPL的变化值之间无差异，1 000 Hz处卡那 ＋ DFO组与对照组无统计学差异外，其余各组各个频率两两相比，差异均有显著性（P <0.01），且用药前后卡那组和卡那 ＋ DFO组多数频率的DPOAE幅值降低有统计学显著性（P < 0.01），所得数据如表1。

　　2.2　耳蜗铺片光镜观察

　　对照组各回毛细胞（包括3排外毛细胞和1排内毛细胞）形态完整，纤毛排列整齐。卡那 ＋ DFO组的内毛细胞没有损害，第三排外毛细胞有缺失，第三和第二排外毛细胞的纤毛均有变形。卡那组与卡那 ＋ DFO组相比，各回毛细胞损伤更重，外毛细胞从第一排到第三排、从顶回到底回其损伤依次加重，损伤细胞数量依次增加（图1 - 3）。

　　2.3　扫描及透射电镜观察

　　扫描电镜对观察：对照组内毛细胞及外毛细胞细胞轮廓清晰，纤毛束形态完整、排列成Ｖ形或Ｗ形；卡那组外毛细胞形态紊乱，轮廓模糊，纤毛束扭曲、粘连、崩解，甚至完全缺失，从第１排到第３排其损伤逐渐加重；卡那 ＋ DFO组的损伤明显减轻，仅见第３排个别外毛细胞纤毛扭曲、粘连、倒伏，V或W形排列消失（图4 - 6）。透射电镜观察：对照组可清晰地看到细胞内的微细结构，细胞核内染色质分布均匀，内质网形态完整，线粒体嵴清晰可见；卡那组：毛细胞内胞浆分布不均、空泡化，细胞器减少，细胞表皮板破坏，细胞内胞浆与细胞器形成假包涵体向表皮板排出，胞核固缩，染色质浓缩、边集，表皮板外的纤毛结构缺失；卡那 ＋ DFO组：只有轻微的胞浆空泡化和胞核染色质  边集，比卡那组的细胞超微结构的变性轻得多（图7 - 9）。

　　2.4　血清学指标：用药后，卡那组的 T-SOD和GSH-PX活力值比对照组和卡那 ＋ DFO组明显降低（P < 0.05），而MDA的活力值则明显比对照组和卡那 ＋ DFO组升高（P < 0.05），所得数据如表2。

　　3　讨　论

　　DFO是一种铁螯合剂，临床上常用于治疗铁中毒和地中海贫血，已有研究证明其长期服用的安全性［14］， Schacht及其同事用铁离子螯合剂观察   其拮抗氨基糖甙类耳毒性作用时发现，铁离子螯合 剂去铁胺可显著降低GM所致阈移，使其不到    10 dB，产生明显保护作用，且不影响GM的抗菌活性［8, 15］。本实验发现卡那组和卡那 ＋ DFO组的DPOAE幅值在用药后都有降低，但低频变化并无显著性，而频率越高，幅值变化幅度越大，从功能上证明了丁胺卡那霉素对耳蜗损害顺序是从底回到顶回；同时，卡那 ＋ DFO组DPOAE幅值变化幅度明显低于卡那组，证实DFO在卡那霉素产生耳毒性的进程中，有效地起到了阻碍作用，换言之，起到了保护听功能的作用。

　　在形态学方面，光镜和电镜显示卡那 ＋ DFO组损伤明显比卡那组轻，卡那组表现为从外毛细胞到内毛细胞 ，从顶回到底回，毛细胞损伤依次加重，这种损伤主要是细胞内膜结构的紊乱、破坏；而卡那 ＋ DFO组仅表现为部分毛细胞的纤毛倒伏，细胞内超微结构的损伤也要轻得多。这与陈阳等［16］的实验相似，听力损害以高频尤为敏感，8 000 Hz听力损害较中低频为甚，与形态学损伤相平行（底回对应高频、顶回对应低频）。形态学的结论证实了以往对氨基糖甙类药物耳毒性作用的研究，即氨基糖甙类药物对听力的影响是基于对耳蜗毛细胞毒性作用的结果；也证明DFO确实能够有效地保护听器，使其超微结构免受损害。形态学结果为听觉功能损失提供了组织病理学的证据。　　　　关于氨基糖甙类抗生素所致耳毒性的机制，国内外有很多假设，如自由基学说［4， 5，　17， 18］，细胞代谢抑制［19］、膜受损［20， 21］、钙离子拮抗和离子通道阻断［2２］等，其中最盛行的是自由基学说，尤其是Schacht及其同事们分别从体内实验和体外实验两方面进行深入的研究，为其自由基理论提示了有力的证据，认为氨基糖甙类耳毒性作用是通过与游离铁离子形成复合物，催化自由基的反应而发挥耳毒性作用［5， 17， 18］。自由基可通过生物膜中的不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，并因此形成脂质过氧化产物如 MDA，其活力也会随之增加，而体内的自由基清除物如T-SOD、GSH-PX的活力会下降。本实验的血清学指标与此相符，但卡那 ＋ DFO组的各个血清学指标的变化方向虽然与卡那组相一致，但幅度要小得多，说明其对抗耳毒性的机制与自由基因相关，DFO有效地阻止了自由基的严重损伤。

【参考文献】  　　１　秦延权， 叶嗣茂， 苏鸿禧，等. 庆大霉素内耳中毒研究. 中华耳鼻咽喉科杂志， 1980， 15（4）: 193-197.

　　2　Bamonte F， Parravicini L, Arpini A. Histological eveluation of ototoxic reaction due to some aminoglycoside antibiotics. Arch Otorhinolarygnol，1980， 228(3): 163-170.

　　3　Kitasoto I, Yokata M, Inoue S, et al. Comparative ototoxicity of ribostamycin, dactimicin, dibekacin, kanamycin, amikacin， tobramycin， gentamicin , sisomicin and netilmicin in the inner ear of guinea pigs. Chemotherapy, 1990, 36(2): 155-168.

　　4　Pierson MG, Moller AR. Prohylaxis of kanamycin-induced ototoxicity by a radioprotectant. Hear Res, 1981, 4(1): 79-87.

　　5　Priuska EM, Schacht J. Formation of free radicals by gentamicin and iron and evidence for an iron/gentamicin complex. Biochem Pharmacol, 1995, 50(11): 1749-1752.

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　　7　印利霞， 薛丽华， 张喜琴，等. 卡那霉素耳毒性和肾毒性关系的研究. 中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志， 2000，8（4）: 160-163.

　　8　Song BB, Schacht J. Variable efficacy of radical scavengers and iron chelators to attenuate gentamicin ototoxicity in guinea pig in vivo. Hear Res, 1996， 94（1-2）: 87-93.

　　9　Conlon BJ, Perry BP, Smith DW. Attenuation of neomycin ototxicity by iron chelation. Laryngoscope, 1998, 108(2): 284-287.

　　1０　丁大连， 郭毓卿， 罗德峰， 等.豚鼠全内耳终器硝酸银染色法. 上海第二医科大学学报， 1989， 9(4): 326-327.