HPV16 E6/E7蛋白与Rb蛋白在人喉鳞状细胞癌中的表达及其相关性的研究

作者：叶青，毕婕，张婷，陈珏，邱淼欣    作者单位：上海市闸北区自然科学基金(2006一般01) 200070 上海，第二军医大学长征医院闸北分院耳鼻咽喉科

【摘要】  目的 观察HPV16早期基因E6/E7表达蛋白与Rb蛋白在喉癌发生中的相关性，为喉癌的病因学探索提供依据。方法 用免疫组织化学方法检测82例喉鳞癌、39例非癌组织标本中HPV16 E6/E7以及Rb的蛋白表达。结果 (1)HPV16 E6/E7和Rb蛋白表达的阳性率在非癌及喉癌组织中差异有显著统计学意义(P<0.01)，HPV16 E6/E7与Rb蛋白的阳性率在非癌组织中呈明显的负相关(P<0.01);(2)喉癌组织中，Rb蛋白在HPV16 E7阳性及阴性组中的阳性率显著不同(P<0.01)，而在HPV16 E6和非癌组织中无此现象(P>0.05)。结论 喉癌组织中HPV16 E7的高表达是导致Rb蛋白功能失活的主要原因。

【关键词】  喉肿瘤;癌，鳞状细胞;HPV16 E6蛋白;HPV16 E7蛋白;Rb蛋白

Study on expression of HPV16 E6/E7 and Rb proteins in human laryngeal squamous cell carcinoma and their relationship

　　YE Qing，BI Jie，ZHANG Ting，et al.Department of Otolaryngology，Zhabei Branch of Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200070，China

　　[Abstract] Objective Observing the correlation of expression of HPV16 E6/E7 and Rb proteins in human laryngeal squamous cell carcinoma to give gists for the etiology search of laryngeal carcinoma.Methods The expression of HPV16 E6/E7 and Rb proteins were detected by the immunohistochemical method in 82 specimens with laryngeal squamous cell carcinoma and 39 specimens with non-carcinoma.Results (1)Between non-carcinoma and laryngeal squamous cell carcinoma tissues，there were different positive rates for the HPV16 E6/E7 and Rb proteins(P<0.01).Between the positive rates of the expression of HPV16 E6/E7 and Rb proteins，there were negative correlation significantly in non-carcinoma tissues(P<0.01);(2)In laryngeal squamous cell carcinoma tissue，there were different positive rates of Rb protein in HPV16 E7(+) and HPV16 E7(-) group(P<0.01);comparing HPV16 E6(+) and HPV16 E6(-) group or non-carcinoma tissues，there were no such difference(P>0.05).Conclusion The over expression of HPV16 E7 protein in human laryngeal carcinoma might be the main factor for the inactivation of Rb protein.

　　[Key words] laryngeal neoplasms;carcinoma，squamous cell;HPV16 E6 protein;HPV16 E7 protein;Rb protein

　　视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)肿瘤抑制基因编码的蛋白质pRb为一重要的肿瘤抑制因子，自发现以来已有许多学者对其进行了研究，发现在许多种类的人类肿瘤中有该蛋白质的变异或缺失。晚近更有学者观察了pRb与喉癌发生的相关性，王斌全等[1]发现，喉癌组织中存在Rb的突变，但Rb基因突变与喉癌病程无关，认为Rb基因突变在喉癌的发生发展中起着一定的作用。英信江等[2]发现，随着喉癌病理及临床分级的提高，喉癌组织中人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16型的早期基因E7表达的蛋白与pRb的表达呈显著的负相关。但前者的研究未揭示该Rb基因突变是否与HPV感染有关，后者的研究在全部喉癌标本中进行，为分别研究HPV16 E7蛋白阳性及阴性时pRb的表达情况并分析两者的相关趋势，尚不足以准确认定喉癌发生时pRb的低表达与HPV16 E7蛋白的表达是否相关。为明确pRb低表达的原因，本文进行了如下试验，现报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 组织标本 选取1996年以来在上海长征医院耳鼻咽喉科因喉部疾患住院手术的病理标本121例，经病理证实，其中喉鳞癌82例，非癌组织39例(声带息肉27例，距肿瘤>1.5 cm的癌周正常组织12例)。

　　82例喉鳞癌患者中，男80例，女2例，年龄38～85岁，平均(60.55±10.65)岁，按2002年国际抗癌联盟(UICC)标准进行临床分期，其中Ⅰ期13例，Ⅱ期17例，Ⅲ期30例，Ⅳ期22例;按肿瘤分化程度将其分为3级，其中Ⅰ级(高度分化)22例，Ⅱ级(中度分化)32例，Ⅲ级(低度分化)28例。所有患者术前未经放疗和化疗。

　　1.2 试剂 实验用兔抗人HPV16 E6单克隆抗体、兔抗人Rb单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司，兔抗人HPV16 E7单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，所用EnVisionTM+加强型免疫组织化学染色试剂盒(K400011)购自DAKO公司。

　　1.3 免疫组织化学方法(EnVision法) 将石蜡切片脱蜡至水;3%过氧化氢(H2O2)孵育10 min，用以清除内源性过氧化物酶，蒸馏水漂洗;加入单克隆抗体(兔抗人HPV16 E6或HPV16 E7或Rb)4 ℃过夜;EnVisionTM+孵育30 min，各步骤之间均用 PBS洗片，常规DAB显色5～10 min，复染，封片。染色时，用已知HPV16 E6，HPV16 E7和Rb反应阳性的宫颈癌切片作阳性对照，用PBS替代一抗作阴性对照。

　　1.4 阳性细胞判定标准 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白均为细胞核染色，以出现棕黄色颗粒为阳性。确定阳性标准：在高倍镜下(×400)对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，共计1 000个。阳性细胞数<5%为阴性(-)，5%～25%为弱阳性(+)，25%～50%为中度阳性(++)，>50%为强阳性(+++)。(+)以上统称阳性表达，余为阴性表达。

　　1.5 统计学处理 根据资料类型采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白的染色结果 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白阳性均表现为细胞核着色，阳性细胞核呈棕色或棕黄色细网状或粗大颗粒状，色泽深浅不等;阳性细胞多呈灶状或弥漫性分布，染色深(图1)。

　　2.2 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白在不同喉黏膜病变中的表达 见表1。如将正常组织及息肉合并为非癌组织，经2×2表的χ2检验，由表1可知，HPV16 E6和HPV16 E7蛋白的表达从非癌组织到鳞癌呈上升趋势(P<0.01)，Rb蛋白的表达从非癌组织到鳞癌呈下降趋势(P<0.01)。

　　进一步分析发现，在非癌组织中，Rb蛋白与HPV16 E6和HPV16 E7蛋白的表达率呈明显的负相关(P<0.01)，提示喉癌的发生与喉癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7的高表达和Rb蛋白的失活有关。

　　2.3 HPV16 E6，HPV16 E7与Rb蛋白的相关性 分别分析非癌与喉癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性和阴性时Rb蛋白的表达情况，结果见表2。由表2可知，经2×2表的χ2检验，在非癌组织中，Rb蛋白的阳性率在HPV16 E6、HPV16 E7阳性和阴性时差异均无显著性(P>0.05);在喉癌组织中，Rb蛋白的阳性率仅在HPV16 E7阳性和阴性时差异有显著统计学意义(P<0.01)。进一步提示Rb蛋白的功能失活仅与HPV16 E7蛋白的表达有关。表1 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白在同喉黏膜组织中的表达注：HPV16 E6与HPV16 E7比较，aP<0.01;与非癌组织比较，bP<0.01表2 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白的相关性 注：与HPV16 E7(+)比较，aP<0.01

　　3 讨论

　　高危型HPV如HPV16在其增殖期需要其早期基因E6、E7的表达[3，4]，有学者观察到，在永生化口腔上皮细胞中，E6通过硫化磷酸化Rb蛋白形成复合物使其失活[5]，E7则主要通过其化学结构与Rb蛋白结合掩蔽其生物活性使Rb蛋白功能失活[6]。Rb作为一重要的抑癌基因，其表达产物pRb在肿瘤的控制中显然起着举足轻重的作用，消除引起pRb功能失活的因素，恢复其正常活力应是喉癌免疫学和基因学治疗研究的焦点。

　　尽管通过不同的途径，E6、E7均能引起pRb的功能失活，Sdek等[5]在口腔上皮的永生化实验中发现，以HPV16 E6及E7的开放阅读框转染正常人口腔上皮，E7在废除口腔上皮细胞的细胞周期调节中起重要作用，而E6只有较小的影响。本组的试验结果也提示在喉鳞状细胞癌中，pRb的功能失活主要与E7的表达有关，而与E6基本无关，为赵舒薇等[7]以HPV16 E7-HSP70融合基因的表达蛋白用于喉癌疫苗的研制工作提供了依据。

【参考文献】  　　1 王斌全，陈彦球，温树信，等.喉癌组织RB基因突变及其与临床分期的关系.临床耳鼻咽喉科杂志，2003，17(2)：89-91.

　　2 英信江，赵舒薇，邱杰，等.HPV16 E7蛋白和Rb蛋白在人喉鳞状细胞癌中的表达及相关性研究.第二军医大学学报，2004，25(12)：1364-1367.

　　3 Asha S Collins，Tomomi Nakahara，Anh Do，et al.Interactions with pocket proteins contribute to the role of human papillomavirus type 16 E7 in the papillomavirus life cycle.Journal of Virology，2005，79(23)：14769-14780.

　　4 Catherine A Harwood，Jane M McGregor，Charlotte M Proby，et al.Human papillomavirus and the development of non-melanoma skin cancer.J Clin Pathol，1999，52：249-253.

　　5 Sdek P，Zhang Zhi-yuan，Cao Jun，et al.Alteration of cell-cycle regulatory proteins in human oral epithelial cells immortalized by HPV16 E6 and E7.Int J Oral Maxillofac Surg，2006，35(7)：653-657.

　　6 Alonso LG，Smal C，Garcia-Alai MM，et al.Chaperone holdase activity of human papillomavirus E7 oncoprotein.Biochemistry，2006，45(3)：657-667.

　　7 赵舒薇，邱杰，英信江，等.HPV16 E7-HSP70融合基因原核表达质粒的构建和鉴定.中国耳鼻咽喉头颈外科杂志，2006，13(2)：67-70.