离体培养时bFGF对顺铂耳蜗毒性的拮抗作用

离体培养时bFGF对顺铂耳蜗毒性的拮抗作用作者：李姝娜    作者单位：中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科， 辽宁 沈阳 110001    【关键词】  离体培养    activation in rat cochlea in vitro  LI Shuna, WANG Xiaoyu, JIANG Xuejun (Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning， China)    Abstract: Objective   Cisplatin of different concentrations can induce hair cell death in the cochlea. To explore if the bFGF of different concentrations prevents ciplatin induced hair cell death and the expression of caspase9. Method   Basilar membranes were cultured and the number of hair cells and the expression of caspase9 were determined by immunofluorescent staining. Results   Cisplatin of 15?μg/ml induced the maximal hair cell death, when it was equal to or higher than 100?ng/ml, bFGF could well prevent ciplatin induced hair cell death. Conclusions   Hair cell death induced by cisplatin is concentrationdependent. BFGF can prevent ciplatin induced hair cell death, which is related to the expression of caspase9.    Key words: Basic fibroblast growth factor; Cisplatin; Hair cell; Caspase9    毛细胞是耳蜗的听觉感受细胞，对维持正常听力起着重要作用。抗肿瘤药物、氨基糖甙类抗生素等耳毒性药物极易引起毛细胞的凋亡。耳蜗的毛细胞缺失可导致不可逆的感音神经性聋，目前对此尚无有效的治疗方案。顺铂是生殖器、头颈部肿瘤化学治疗的常用药物；由于耳、肾毒性的存在，其临床应用受到了限制。顺铂的耳毒性作用机理尚不完全清楚。    碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）作为一种细胞生长因子，可促进来源于外胚层和中胚层的多种细胞的分裂增殖。外源性bFGF具有保护离体听神经元，促进其生长的营养作用［1］，可以降低谷氨酸钠对螺旋神经节细胞的影响［2］，拮抗豚鼠的庆大霉素中毒性耳聋的损害［3］。本研究对离体培养条件下顺铂剂量与耳蜗基底膜毛细胞损伤间的关系，bFGF对顺铂所致耳蜗基底膜细毛胞损伤的拮抗作用，及bFGF、顺铂对细胞凋亡信号传导的影响进行了研究。1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  实验动物  出生4?d左右的Wistar幼鼠80只。    1.1.2  实验试剂  含有10%胎牛血清、100?IU/ml青霉素的DMEMF12(Hyclone)培养液，胶原凝胶，TriticPhalloidin荧光染色试剂（Sigma），兔抗鼠caspase9抗体(Santa cruz)，FITC标记羊抗兔IgG(Santa cruz)，顺铂注射液(云南个旧生物药业)，bFGF（Protech）。    1.2  取材及培养  预先在每只培养皿中滴入2滴胶原凝胶后，加入培养液。无菌条件下将幼鼠断头，取出耳蜗，于解剖显微镜下完整分离耳蜗基底膜。将耳蜗基底膜正面向上平铺于滴好的凝胶上，每皿中有同一幼鼠的2条基底膜。于5%CO2培养箱中37?℃下培养。    1.3  实验方法    1.3.1  不同浓度顺铂对耳蜗基底膜上毛细胞的影响  将20只幼鼠随机分为4组，每组5只。取出耳蜗基底膜铺于胶上，于5%CO2、37?℃培养24?h后更换培养液，向各组培养皿中加入含不同浓度顺铂的培养液。分别为A：对照组（不含顺铂）；B：5?μg/ml顺铂；C：10?μg/ml顺铂；D：15?μg/ml顺铂。于同样条件继续培养24?h。    1.3.2  不同浓度bFGF对10?μg/ml顺铂所致耳蜗基底膜毛细胞损伤的拮抗作用  将30只幼鼠随机分为6组，每组5只，取材，培养24?h后更换培养液，向6组培养皿中加入含有10?μg/ml顺铂和不同浓度bFGF的培养液。A：只含有10?μg/ml顺铂；B：10?μg/ml顺铂+10?ng/ml bFGF；C： 10?μg/ml顺铂+50?ng/ml bFGF； D：10?μg/ml顺铂+100?ng/ml bFGF； E：10?μg/ml顺铂+200?ng/ml bFGF；F：10?μg/ml顺铂+1?000?ng/ml bFGF。为了避免顺铂与bFGF之间可能发生的相互作用，此组中换液时均先加入bFGF，30?min后再加入顺铂。于同样条件继续培养24?h。    1.3.3  bFGF对顺铂所致耳蜗基底膜毛细胞损伤的拮抗作用  将20只幼鼠随机分为4组，每组5只，取材，培养24?h后更换培养液，向4组培养皿中加入不同的培养液。A：不含处理因素（对照组）；B：100?ng/ml bFGF；C：10?μg/ml顺铂+100?ng/ml bFGF；D：10?μg/ml顺铂。于同样条件继续培养24?h。    1.4  TriticPholloidin荧光染色对毛细胞进行计数  以上3组实验均在培养48?h后，进行免疫荧光染色。丢弃培养液，加入10%福尔马林磷酸盐缓冲液4?℃固定过夜，PBS液冲洗，将耳蜗基底膜连同凝胶从培养皿中取出，置于TriticPholloidin Work Solution中4℃避光染色30?min，PBS液冲洗。将染色后的耳蜗基底膜连同凝胶共同铺于载玻片上，甘油封片，盖片，于正置荧光显微镜下观察，40倍镜下（40×LUCP）拍照，每个耳蜗基底膜自顶端向下调整5个视野后，连续观察4个视野并照相，对每个视野中包含的毛细胞进行计数，对同一基底膜的4个视野中的毛细胞数量取均值。    1.5  Caspase9表达的检测  取1.3.3中另外4组基底膜进行免疫荧光染色。培养48?h之后，丢弃培养液，加入10%福尔马林磷酸盐缓冲液4?℃固定过夜，PBS液冲洗，2%BSA封闭液封闭1?h，加入兔抗鼠caspase9抗体，37?℃水浴2?h，PBS液冲洗。再加入Fitic标记的羊抗兔抗体37?℃水浴1?h。PBS液冲洗后观察。将染色后的耳蜗基底膜连同凝胶共同铺于载玻片上，甘油封片，盖片，于正置荧光显微镜下观察，40倍镜下（40×LUCP）拍照，每个耳蜗基底膜自顶端向下调整5个视野后，连续观察4个视野并照相。    1.6  统计学处理  应用SPSS11.0对各组中的毛细胞数量进行单因素方差分析。P值<0.05为组间差异有统计学意义。2  结  果    2.1  不同浓度的顺铂对耳蜗基底膜毛细胞的影响  在1个40倍镜视野下，各组中内、外毛细胞数量以±s表示。毛细胞数量随顺铂浓度的增加而减少，顺铂浓度低于10?μg/ml时，以外毛细胞的数量减少为主，内毛细胞数量无明显改变；浓度高于10?μg/ml时，内、外毛细胞数量均明显减少（表1）。4组中耳蜗基底膜上内毛细胞和外毛细胞数量的差异均有统计学意义（P<0.05）。实验中，耳蜗基底膜毛细胞的纤毛及表皮板被TriticPholoidin染成红色。其中，A组（对照组）与B组（5?μg/ml顺铂）的毛细胞排列整齐，无缺失，纤毛形态规则，着色均匀。C组（10?μg/ml顺铂）耳蜗基底膜外毛细胞有明显缺失。残存的外毛细胞排列紊乱，纤毛着色成团块状，失去原有形态。内毛细胞有少量缺失。D组（15?μg/ml顺铂）耳蜗基底膜外毛细胞几乎全部消失，内毛细胞亦有大量缺失。表1  不同浓度的顺铂对耳蜗基底膜上内、外毛细胞数量的影响    2.2  不同浓度的bFGF对同一浓度顺铂所致耳蜗基底膜毛细胞损伤的拮抗作用   在1个40倍镜视野下，各组中内、外毛细胞数量以±s表示。当bFGF浓度小于100?ng/ml时，外毛细胞数量随着bFGF浓度的增加而增加，大于等于100?ng/ml时，bFGF对外毛细胞有着良好的保护作用，外毛细胞无缺失。各组中内毛细胞均无明显缺失（表2）。6组中耳蜗基底膜上外毛细胞数量差异有统计学意义（P<0.05）。内毛细胞数量差异无统计学意义（P>0.05）。其中A组（10?μg/ml顺铂）与B组（10?μg/ml顺铂+10?ng/ml bFGF）只有少量残存的外毛细胞，排列紊乱，纤毛着色不均，内毛细胞少量缺失。C组（10?μg/ml顺铂+50?ng/ml bFGF）外毛细胞数量较A、B两组多，内毛细胞仍有少量缺失。D组（10?μg/ml顺铂+100?ng/ml bFGF）、E组（10?μg/ml顺铂+200?ng/ml bFGF）和F组（10?μg/ml顺铂+1?000?ng/ml bFGF）内、外毛细胞均排列整齐，无缺失，纤毛着色均匀，形态规则。表2  不同浓度的bFGF对同一浓度（10?μg/ml）顺铂所致耳蜗基底膜毛细胞损伤的拮抗作用　  2.3  bFGF对顺铂所致耳蜗基底膜毛细胞损伤的拮抗作用  在1个40倍镜视野下，各组中内、外毛细胞数量以±s表示。对照组、加入bFGF的实验组与加入顺铂及bFGF的实验组中，外毛细胞数量无显著差异。加入顺铂的实验组中只有少量残存的外毛细胞。各组中内毛细胞数量无显著差异（见表3）。4组耳蜗基底膜上外毛细胞数量差异有统计学意义（P<0.05），A、B、C三组之间外毛细胞数量的差异无统计学意义，各实验组间的内毛细胞数量差异无统计学意义（P>0.05）。其中A组（对照组）与B组（100?ng/ml bFGF）耳蜗基底膜上毛细胞排列整齐，无缺失，纤毛形态规则，着色均匀。C组（10?μg/ml顺铂+100?ng/ml bFGF）耳蜗基底膜上毛细胞基本无缺失，排列整齐，纤毛形态同对照组一致。D组（10?μg/ml顺铂）耳蜗基底膜上外毛细胞大量缺失，残存的外毛细胞排列紊乱，不整齐，在原有的外毛细胞丢失后，可见其下方的细胞基板轮廓。内毛细胞排列整齐（彩图22）。        2.4  2.3中各组耳蜗基底膜上caspase9的表达  应用免疫荧光方法对2.3中各组耳蜗基底膜上caspase9进行FITC标记的荧光染色。A组（对照组）及B组（100?ng/ml bFGF）中耳蜗基底膜上的caspase9表达很少，D组（10?μg/ml顺铂）caspase9大量表达，C组（10?μg/ml顺铂+100?ng/ml bFGF）中耳蜗基底膜上caspase9表达较少（彩图23）。3  讨  论    bFGF具有广泛的生物学作用，可影响来源于外胚层的多种细胞生长、分化［4］，近来研究发现，bFGF可诱导耳蜗基底膜毛细胞的分化［5］，并在Corti器的内外毛细胞、血管纹、螺旋神经元等多个位置具有表达；bFGF可能与听觉疾病之间存在较为密切的关系［6］。本实验揭示了顺铂剂量与其所致耳蜗基底膜毛细胞损伤之间的关系：在顺铂作用下首先出现外毛细胞损伤，当顺铂浓度进一步升高时，内毛细胞的损伤也开始出现。bFGF对顺铂所致耳蜗基底膜毛细胞损伤起到了很好的拮抗作用，这种拮抗作用并非随浓度的增加而持续增加：当浓度小于100?ng/ml时，bFGF的保护作用随浓度的增加而增加；当浓度大于等于100?ng/ml时，保护作用相同。这种保护作用的上限可能与毛细胞上bFGF受体达到饱和有关。    许多信号刺激可以诱导细胞发生凋亡。细胞凋亡后期的共同途径是caspases的激活。caspase9是细胞凋亡信号传导路上caspases家族中的重要因子［7］。通过对caspase9进行荧光染色，发现顺铂引起的耳蜗毛细胞损伤与caspase9的活化有关。bFGF通过抑制顺铂引起的caspase9活化，从而抑制耳蜗基底膜毛细胞的损伤。该结果表明，顺铂所致耳蜗基底膜毛细胞的死亡与细胞凋亡信号传导中caspases途径的激活有关。而bFGF也因降低caspase9活化，抑制耳蜗基底膜毛细胞中caspases凋亡途径，而对顺铂所致耳蜗基底膜毛细胞的损伤起到了拮抗作用。    体外培养具有简化细胞生化环境、便于施加实验因素等优点。本实验中，选用含有10% FBS的DMEMF12做为培养液。DMEMF12价格低廉，以前常用于骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。在对耳蜗基底膜进行48?h原代培养的过程中，未出现因培养条件所致细胞死亡的情况，为耳蜗基底膜细胞培养提供了价廉质优的培养条件。    本实验结果显示，在体外培养的条件下，bFGF对顺铂所致耳蜗基底膜毛细胞的损伤有着显著的拮抗作用，为临床中减轻顺铂的耳毒性作用提供了一个新的研究方向。【参考文献】［1］ 孙建军, 汪吉宝, 李桂榕. 生长因子对离体听神经元存活与轴突再生的影响［J］.中华耳鼻咽喉科杂志, 1996, 31:274276.［2］ 王大君, 韩东一, 杨伟炎, 等. 碱性成纤维细胞生长因子对耳蜗螺旋神经节细胞谷氨酸钠毒性作用的影响［J］. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1998, 33:165168.［3］ 魏佑震, 洪岸, 史献君, 等. bFGF对豚鼠庆大霉素中毒性耳聋的预防作用［J］. 中国病理生理杂志, 2002, 18(9)∶11471148.［4］ Klagsbrun M, Baird A. 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