复智散对阿尔茨海默病模型小鼠认知功能及脑内胆碱能系统的影响

　　作者：汤颖 李绪领 王德生 作者单位：哈尔滨医科大学第一临床学院神经内科，黑龙江 哈尔滨 150001

　　【摘要】 目的 观察复智散(FZS)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠认知功能及脑内胆碱能系统的影响。方法 采用β-淀粉样肽(Aβ25-35)小鼠侧脑室注射制作AD小鼠模型，应用水迷宫和小鼠穿梭程序自动控制仪检测小鼠的认知功能，采用比色法测定小鼠脑内胆碱乙酰基转移酶(ChAT)和乙酰胆碱脂酶(AchE)活性，采用碱性羟胺法测定乙酰胆碱(Ach)含量。结果 FZS能明显改善AD小鼠的认知功能，且对脑内胆碱能系统有明显的调节作用，不仅能够降低AchE活性，而且能够增强ChAT活性，增加脑内Ach的含量。结论 FZS可通过对脑内胆碱能系统的调节来改善其认知功能，从而达到治疗AD的效果。

　　【关键词】 复智散;阿尔茨海默病;胆碱乙酰基转移酶;乙酰胆碱脂酶;乙酰胆碱;认知功能

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(30670726);黑龙江省自然科学基金重点项目(ZJY03-5);黑龙江省青年科技专项基金(QC05C86)

　　Effect of Fuzhisan(FZS) on cognitive ability and cholinergic system of Alzheimer′s disease (AD) model mice

　　TANG Ying, LI Xu-Ling, WANG De-Sheng.

　　Department of Neurology，the First Hospital，Ha′erbin Medical University，Ha′erbin 150001,Heilongjiang，China

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of FZS on cognitive ability and cholinergic system in the brain of Alzheimer′s disease (AD) model mice induced by intraventricular Aβ25-35 injection.Methods The AD model mice was established by injected Aβ25-35 to lateral ventricle.The cognitive ability of AD model was detected by water amaze test and shuttle box test.The activity of acetylcholinesterase(AchE) and choline acetyltransferase(ChAT) in the brains were examined by colorimetric method.The acetylcholine(Ach) content was examined by alk hydroxylamine colorimetric method.Results FZS effectively improved cognitive performance，including learning and memory ability of the AD model mice，and not only degraded AchE activity，but also enhanced ChAT activity and Ach content in the AD model mice brain.Conclusions FZS can effectively improve cognitive performance by regulating cholinergic system function in the brain and cure AD.

　　【Key words】 FZS;AD;ChAT;AchE;Ach;Cognitive ability

　　阿尔茨海默病(AD)是引起老年痴呆的主要原因，65岁以上的老年人中AD的患病率约占10%，而85岁以上的老年人中，AD的患病率可占20%〔1〕。随着世界人口的快速老龄化，AD的患病率逐年增高。关于AD的发病原因，虽然有多种假说，但至今尚不清楚。复智散(FZS)是由王德生自创组方中药复方制剂，临床及实验室研究证明FZS治疗AD有效：FZS可改善老龄鼠的水迷宫试验、跳台避害试验〔2〕;FZS对抗Aβ毒性提高体外细胞存活率〔3〕，明确提高单光子发射断层扫描(SPECT)脑血流量〔4〕;FZS治疗AD患者可改善认知功能，提高生活能力〔4〕。FZS对胆碱能系统的影响尚未做深入研究。本实验采用Aβ25-35侧脑室注射制作AD小鼠模型，以观察FZS对胆碱能系统的影响，并再次验证其改善认知功能的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 3月龄昆明雄性小鼠40只，体重(22±2) g，由北京军事医学科学院动物中心提供。自由食水，每天照明12 h，室温(23±1)℃。

　　1.2 药品及主要试剂 FZS由人参、黄芩、节菖蒲等中药组成，该复方中全部中药均购自哈尔滨市药材公司。按比例混合，加水浸泡40 min，煎煮1 h，滤出药汁，加水继续煎煮40 min后过滤，将两次滤出的药汁混合，配成0.25 g生药/ml的FZS水提液，4℃保存。实验中给药剂量以水提液中所含生药的量计算。Aβ25-35(Sigma公司)，胆碱乙酰基转移酶(ChAT)检测试剂盒、乙酰胆碱脂酶(AchE)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为：20050721和20050725)，毒扁豆碱(ALEXIS公司)，氯化羟胺(北化公司)。

　　1.3 主要仪器 UV-250型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);20PR-5型高速冷冻离心机(日本日立公司);DK-8AX型恒温水浴箱(上海一恒仪器);Morris水迷宫自动控制仪装置和XCS2小鼠自动穿梭控制仪(中国医学科学院药物研究所)。

　　1.4 实验动物的筛选 正式实验前，对小鼠进行Morris水迷宫及自动穿梭控制仪检测，由两个像限找到平台的平均时间(潜伏期)大于30 s或10次循环的电击时间超过20 s的小鼠为先天愚钝鼠，被淘汰，正常小鼠用于实验。

　　1.5 动物模型的制备 将Aβ25-35溶于无菌生理盐水中，浓度为1 mg/ml。密封后于37℃培养箱内孵育96 h，使之成为凝聚态，参照Maurice的方法进行小鼠侧脑室内Aβ注射〔5〕，注射剂量为每只小鼠4 μl，假手术组注射相同体积的生理盐水。注射11 d后对Aβ注射小鼠进行Morris水迷宫及自动穿梭控制仪检测，由两个像限找到平台的平均潜伏期大于90 s或10次循环的电击时间超过20 s的小鼠，为造模成功鼠。将造模成功的小鼠用于实验。

　　1.6 动物分组及给药方法 小鼠被随机分成对照组、假手术组(注射相同体积的生理盐水)、模型组、治疗组(n=10)。治疗组按2.5 g(生药)·kg-1·d-1灌胃FZS水提液，模型组灌胃相同体积的生理盐水，连续给药21 d。

　　1.7 检测指标及方法

　　1.7.1 一般情况观察 包括饮食、背毛、活动等。

　　1.7.2 行为学检测 通过Morris水迷宫记录潜伏期的长短测定小鼠的空间辨别能力，将小鼠由两个不同的像限放入水中，记录小鼠两次找到平台所需要的平均时间(潜伏期)。通过自动穿梭控制仪记录的电击时间测定小鼠的学习记忆能力，仪器设定循环10次，间隔3 s，每次嗡鸣时间3 s，电击时间4 s，记录总的电击时间。

　　1.7.3 检测小鼠脑内乙酰胆碱(Ach)含量及ChAT、AchE活性 各组饲养21 d后断头处死小鼠，于冰台上取出脑组织，剔除小脑及脑干。冰生理盐水冲净表面血迹，滤纸拭干，电子天平称重。在冰盒内使用玻璃匀浆器制备10%的脑组织匀浆，4℃离心(4 000 r/min×10 min)，取上清进行实验。按ChAT、AchE测试试剂盒说明测定ChAT、AchE活性。AchE活性测定原理：AchE水解Ach生成乙酸和胆碱，胆碱可以与羟基显色剂反应生成对三硝基苯(TNB)黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可以反应AchE活性(单位：U/mgprot)。考马斯亮兰法测定蛋白含量。用碱性羟胺法测定Ach含量〔6〕。取脑组织匀浆0.8 ml加1.4 ml蒸馏水混合，加1.5 mmol/L毒扁豆碱0.2 ml，缓慢加入1.84 mmol/L三氯乙酸0.8 ml，充分混合，离心(5 000 r/min×5 min)后取上清1.0 ml，加入碱性羟胺(14%氢氧化钠与14%氯化羟胺等体积混合而成)1.0 ml，室温放置15 min后，依次加入 4 mol/L盐酸、0.37 mol/L三氯化铁各0.5 ml。充分混匀，492 nm处比色。标准管为0.2 μmol/ml的Ach代替脑组织匀浆(单位：μmol/mgprot)。

　　1.8 统计分析 本实验数据符合正态分布用x±s表示，组间比较采用t检验。采用SPSS8.0统计软件分析处理数据。

　　2 结果

　　2.1 一般情况 模型组小鼠饮食减少，背毛无光泽，呆卧少动且行动迟缓。治疗组小鼠的一般情况好于模型组。

　　2.2 行为学检测 Morris水迷宫记录小鼠的潜伏期，潜伏期越长则空间辨别能力越差。实验结果显示：模型组小鼠的潜伏期明显长于治疗组和对照组,二者差异显著(P<0.05，P<0.01)，假手术组与对照组潜伏期比较,无统计学意义(表1)。小鼠穿梭程序自动控制仪记录小鼠在被动回避过程中受到的电击时间，电击时间越长，则学习、记忆障碍越明显。实验结果显示：模型组小鼠的电击时间明显长于治疗组和对照组,二者差异显著(均P<0.01)，假手术组与对照组电击时间比较,无统计学意义(表1)。

　　2.3 胆碱能系统检测 ChAT活性检测结果显示：模型组小鼠ChAT活性低于治疗组,二者差异显著(P<0.05)，且明显低于对照组，二者差异显著(P<0.01)，假手术组与对照组ChAT活性比较,无统计学意义(表2)。AchE活性检测结果显示：模型组小鼠AchE活性低于治疗组和对照组,二者差异显著(P<0.01)，假手术组与对照组AchE活性比较,无统计学意义(表2)。Ach含量测定结果显示：模型组小鼠脑内Ach含量低于治疗组和对照组,二者差异显著(P<0.05，P<0.01)，假手术组与对照组脑内Ach含量比较,无统计学意义(表2)。

　　表1 FZS对AD模型鼠认知功能影响(略)

　　与模型组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

　　表2 FZS对AD模型鼠胆碱能系统的影响(略)

　　与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

　　3 讨论

　　AD是一种进行性神经系统变性疾病，以认知功能障碍为主要临床特征。AD的中枢神经系统病理学特征包括老年斑、神经原纤维缠结、神经元的丢失等。其中与认知功能障碍密切相关的中枢神经系统改变是胆碱能系统的损伤，且胆碱能系统的损害程度与AD的严重程度相关〔7，8〕。学者们认为AD患者脑内胆碱能神经递质受累，且Ach的丧失与老年斑的数目及智能的损害有关。因此，人们试图通过抑制AchE的活性来增加中枢神经系统Ach的含量，从而改善AD患者的临床症状。ChAT是胆碱能神经元的特殊标志，也是催化Ach合成的限速酶，常用来研究中枢神经系统胆碱能神经元的含量或用作Ach含量的间接指标〔9〕。有报道，Aβ25-35侧脑室注射诱发的AD小鼠模型，其学习和记忆功能障碍与ChAT的活性降低有关〔10〕。虽然AD的发病机制仍不清楚，但可以肯定的是AD的病因是多方面的。因此，单一靶点的药物很难取得满意效果，中药治疗疾病具有多靶点的特点，在发掘治疗AD的新药方面具有广阔的前景。大量的资料表明，多种天然药物而不是单一方向的AchE抑制剂，具有治疗认知功能障碍的巨大潜能〔11〕。研究发现，FZS能对抗Aβ的细胞毒性;改善AD模型鼠的空间学习和记忆能力〔2〕，改善AD患者的行为、情感及语言能力;SPECT半定量法测定AD患者局部脑血流量的研究证实，FZS对额叶、顶叶和扣带回的脑血流量有明显改善作用〔4〕。本实验结果表明，FZS对胆碱能系统有明显的调节作用，且能明显改善AD小鼠的认知功能，不仅能够降低AchE活性，而且能够增强ChAT活性，增加脑内Ach的含量。代偿AD发病过程中胆碱能神经元的丢失和脑内Ach含量的减少，从而达到治疗AD的效果。这些实验结果将作为我们对FZS进行进一步临床及实验室研究的基础。

　　【参考文献】

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