钙激活蛋白酶与蛋白酶体抑制剂诱导细胞凋亡的机制

　　作者：张瑜 常明 韩威 胡轶虹 王秋艳 胡林森 作者单位：吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 探讨蛋白酶体抑制剂诱导PC12细胞凋亡的作用通路，为深入研究泛素-蛋白酶体系统(UPS)功能障碍诱发细胞凋亡发病机制提供新线索。方法 建立PSI诱导的PC12细胞模型，在48h提取蛋白，应用荧光差异凝胶电泳(DIGE)系统获得差异蛋白点，运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF Pro MS)鉴定出差异蛋白。结果 实验组与对照组比较，在48 h看到细胞凋亡(细胞核呈固缩状或碎裂状)，凋亡率达14.86%。实验组钙激活蛋白酶(calpain)与对照组比较表达量显著增高，有统计学意义(P<0.05)。结论 首次发现在蛋白酶体抑制PC12细胞模型中calpain蛋白表达显著增高。结合GRP78和GRP94表达上调的发现提示内质网应激(ERS)在UPS功能障碍引起细胞凋亡过程中扮演重要角色。

　　【关键词】 钙激活蛋白酶;内质网应激;泛素-蛋白酶体系统

　　基金项目：吉林省科技厅基金资助课题(200505200)

　　Apoptosis induced by calpain and proteasomes inhibitor

　　ZHANG Yu, CHANG Ming, HAN Wei, et al.

　　Department of Neurology, First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To explore the action pathway of proteasomes inhibitor (PSI) induced PC12 apoptosis to provide new clue for studying pathogenesis of ubiquitin-proteasomes system (UPS) dysfunction induced apoptosis. Methods The protein of PC12 cell model induced by PSI was extracted 48 h later to obtain difference protein site by fluorescence differential gel electrophoresis (DIGE) and to identify difference protein by MALDI-TOF Pro MS. Results In experimental group, cell apoptosis was seen, presenting pyknosis or chipped cellular nucleus, apoptosis rate was 14.86%. Calpain expressions in experimental group were significantly higher than that in control group(P<0.05).Conclusions The increased calpain expressions in PSI-induced PC12 cell model are found firstly, combining the upregulated GRP78 and GRP94 expressions could indicate that endocytoplasmic reticulum stress (ERS) play an important role in cell apoptosis induced by UPS dysfunction.

　　【Key words】 Calpain;Endocytoplasmic reticulum stress (ERS);Ubiquitin-proteasomes system (UPS)

　　凋亡又称程序性细胞死亡，它对生物体的生长发育及机体的代谢平衡起着重要的作用。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)是细胞内重要的非溶酶体蛋白降解系统。目前认为UPS功能异常可引起细胞凋亡，与凋亡调控相关因子通过UPS降解相关〔1〕，但其作用的传导通路尚不清楚。蛋白质组学是高通量、高分辨率的蛋白质研究方法，采用高分辨率的蛋白质分离手段结合高效率的蛋白质鉴定技术，全景式地研究在各种特定环境下细胞或组织的全部蛋白质。本实验运用蛋白质组学的方法，利用蛋白酶体抑制剂PSI(proteasome inhibitor 1，ZIE〔O-tBu〕-A-leucinal)诱导PC12细胞凋亡模型，寻找与凋亡相关蛋白，为探讨UPS功能异常引起细胞凋亡的作用通路提供新线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 PC12细胞由中科院上海细胞库提供。PSI购自Merck公司。高糖DMEM培养基购自GiBco公司;新生牛血清购自杭州四季青公司;L-谷氨酰胺、DMSO、胰蛋白酶购自Sigma公司;Clean-up试剂盒、2D Quant试剂盒、固相24cm IPG胶条 (pH 3-10)、CyDye荧光染料(Cy2，Cy3，Cy5)、以及其他双向电泳和质谱分析试剂均购自GE Healthcare-Biosciences公司。Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪、DALT Six垂直电泳系统、切胶仪、酶切仪、点靶仪和基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF Pro MS)均由GE Healthcare -Biosciences公司提供。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养 用含10%的热灭活新生牛血清、1.5 mmol/L L-谷氨酰胺、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基培养细胞。选取对数生长期细胞，用0.05%的胰蛋白酶消化后，以2×105/ml密度接种于25 cm2培养瓶(10 ml/瓶)。孵育24 h后，实验组和对照组分别加入PSI(DMSO溶解终浓度为10 μmol/L)和DMSO(终浓度为10 μmol/L)，继续孵育48 h。取三批不同代数的细胞进行培养。

　　1.2.2 蛋白提取 收取细胞，加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，30 mmol/L Tris)，经室温作用1 h后离心取上清。蛋白样品经Clean-up试剂盒去除杂质后，再用2D Quant试剂盒测定浓度。

　　1.2.3 分析胶制备 将各样品pH值调至8.5，进行分组并制备内标，再以400 pmol CyDye:50 μg蛋白的比例标记各样品及内标，冰浴避光30 min后用1 μl 10 mmol/L赖氨酸终止反应。

　　分别混合各胶样品及内标，与水化液(7 mmol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，15 mmol/L DTT、0.5%IPG buffer)混合成450 ml，在IPGphor Ⅱ等电聚焦电泳系统上水化和等电聚焦(水化 6 h、30 V 6 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 7 h)。结束后，胶条依次在含1% DTT的平衡液(50 mmol/L Tris-HCl，6 mmol/L尿素，30%甘油，2%SDS，痕量溴酚蓝)和含4%碘乙酰胺的平衡液中各平衡15 min。然后将IPG胶条转移至厚度为1 mm的12.5% SDS-PAGE凝胶上端，以2 W/胶恒功率进行双向电泳，直至溴酚蓝到达胶的底端。用Typhoon 9400成像系统扫描双向电泳凝胶。扫描后的图像文件用DeCyder软件分析，找出蛋白表达差异点。

　　1.2.4 蛋白质鉴定 取对照组及实验组蛋白样品各600 μg，酸性端放置蛋白分子量标志，按分析胶方法进行双向电泳。考马斯亮兰染色后切取与差异蛋白相匹配的蛋白点，经酶切(20 μg/L胰酶，37℃，2 h)、点靶后，应用MALDI-TOF质谱分析蛋白质肽质量指纹谱，并将结果输入NCBI蛋白质数据库进行检索。

　　2 结果

　　2.1 PSI诱导PC12细胞模型 见图1。实验组和对照组分别给予PSI、DMSO 孵育48 h，用吖啶橙和溴化乙啶染色，对照组见细胞染色质着绿色荧光，细胞结构显示正常。实验组可见细胞凋亡(细胞核染色增强、呈固缩状或碎裂状)，凋亡百分率为14.86%。

　　A:对照组PC12细胞;B：PSI处理48 h的PC12细胞(箭头所指为凋亡细胞)。比例尺为2 μm。

　　图1 吖啶橙和溴化乙啶染色显示PSI诱导的PC12细胞凋亡(略)

　　2.2 实验组与对照组的DIGE分析及蛋白鉴定 实验组与对照组用DeCyder软件分析蛋白质表达量差异。其中编号为1328的蛋白点升高1.41倍，有显著性差异(P<0.05)，见图2。经MALDI-TOF质谱分析，该蛋白为calpain small subunit(期望值：0.003，序列覆盖率：33.1%，分子量28.18，NCBI数据库编号：gi1794205)，肽质量指纹谱见图3。

　　图2 a、a′;分别为对照组1328蛋白点对应的凝胶图及其三维图;b、b′：分别为PSI处理48h组与对照组1328蛋白点对应的凝胶图像及其三维图。

　　图2 蛋白点1328凝胶图像和三维模拟图像(略)

　　图3 1328蛋白点肽质量指纹谱(略)

　　3 讨论

　　UPS是细胞内重要的非溶酶体蛋白降解系统，可清除真核细胞中突变、损伤和异常折叠的蛋白质，起到调控蛋白质、维持细胞内环境稳定的作用。它参与很多疾病的病理过程如自体免疫性疾病、肿瘤和脑卒中等。许多与凋亡相关的调节分子如Caspase-3、Bcl-2等是通过UPS降解的，一些凋亡抑制因子本身具有泛素连接酶的活性〔2〕。

　　DIGE是研究蛋白质差异表达的最先进的方法之一，与经典双向电泳相比具有很多优点。首先，对每块双向电泳凝胶上的每一个点采用内标系统，缩小了胶与胶之间的变异，能最大程度降低实验偏差。其次，采用分子量和电荷匹配的、光谱分开的CyDyeTM DIGE荧光素，在一块2-D胶上可以同时分离最多3种样品，有利于蛋白点的量化和匹配。再次，对蛋白染色的灵敏度高，并有良好的线性关系，可检测出更多真实的差异表达，可鉴别出较小的差异，并保证统计学的可靠性。最后，多个样品在同一块胶上同时共分离，大大提高通量，简化分析过程，并极大地减少实验操作时间。

　　Calpain又称CANP (calcium activated neutral protease)，是一种广泛存在于多种组织和细胞中的钙离子依赖性半胱氨酸蛋白水解酶，在哺乳动物细胞中广泛分布。它与Caspase是调节细胞病理性死亡的两个重要的半胱氨酸蛋白酶家族。28 kDa calpain亚单位具有激活和稳定同功酶mu- and m-calpain的作用。m-calpain与Caspase-12酶原活化有关。在脊髓侧索硬化症转基因鼠中，当过多表达抗凋亡蛋白XIAP时可降低calpain活性〔3〕。徐冬梅等〔4〕发现calpain-1抑制剂可减少大鼠急性缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡。这些研究证实calpain与凋亡密切相关。本研究中，实验组与对照组比较细胞凋亡率达14.86%，同时观察到28 kDa calpain小亚单位表达显著增加，这为calpain表达增加与凋亡密切相关提供了新的证据。

　　除受体活化凋亡途径和线粒体凋亡途径外，近来内质网凋亡途径受到越来越多的重视。在内质网凋亡途径中，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)导致的非折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)扮演重要角色。研究表明calpain缺乏，抑制ERS诱导的细胞凋亡，应用calpain抑制剂(E64或MDL28170)可抑制氧和糖缺乏(OGD)引起的Caspase-12裂解，表明OGD引起的Caspase-12活化是由calpain介导〔4〕。目前的实验观察到ERS和UPR的标志物GRP78和GRP94表达显著上调(待发表)，证明在UPS功能障碍时确实有ERS和UPR的存在。本实验中28 kDa calpain小亚单位表达显著增加，其机制可能是ERS和UPR促进calpain的表达诱导凋亡。

　　通过对PubMed数据库的检索，在UPS功能异常模型中本研究首次发现UPS功能障碍诱导的PC12模型中calpain表达显著增高，这为ERS参与UPS功能障碍引起的细胞凋亡变化过程提供了新的证据。

　　蛋白酶体抑制通过ERS和UPR影响细胞凋亡，这不仅对揭示人类的一些疾病如帕金森病的成因具有理论意义，而且对于应用蛋白酶体抑制剂治疗肿瘤等疾病也具有重要意义。

　　【参考文献】

　　1 Zhang HG，Wang J，Yang X,et al.Regulation of apoptosis proteins in cancer cells by ubiquitin〔J〕.Oncogene,2004;23(11):2009-15.

　　2 Wójcik C.Regulation of apoptosis by the ubiquitin and proteasome pathway〔J〕.J Cell Mol Med,2002;6(1):25-48.

　　3 Wootz H，Hansson I，Korhonen L,et al.XIAP decreases caspase-12 cleavage and calpain activity in spinal cord of ALS transgenic mice〔J〕.Exp Cell Res,2006;312(10):1890-8.

　　4 徐冬梅,刘正湘.Calpain抑制剂I对大鼠急性缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡的影响〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志,2001;10(2):160-3.

　　5 姜 山,谢 清.内质网应激与细胞凋亡〔J〕.国外医学·流行病学、传染病学分册,2004;31(6):330-3.