连接蛋白29在小鼠耳蜗中的表达

作者：张延平 作者单位：解放军总医院第二附属医院耳鼻喉科 北京 100091 《山东大学学报（医学版）》2007年11月45卷11期 文章   【摘要】  目的 研究连接蛋白29（connexin 29, Cx29）在小鼠内耳的表达，探讨Cx29突变致聋的原因。方法 野生型小鼠耳蜗冰冻切片，用神经丝蛋白(neurofilament, NF)、髓鞘相关糖蛋白抗体（myelin associated glycoprotein, MAG）和神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体与Cx29抗体行双重免疫荧光染色，荧光显微镜观察染色结果。结果 Cx29主要表达于位听神经和螺旋神经节细胞髓鞘，MAG与Cx29的共同表达于内耳位听神经处，表达呈圈状；GFAP只在内听道以外的脑干部位表达，与Cx29无共同表达；Cx29形成一个个圈样围绕NF；血管纹处可见Cx29微量表达。结论 Cx29在小鼠内耳中大量表达，可能对维持小鼠正常听觉功能起重要作用。

【关键词】  连接素29 髓鞘 耳蜗雪旺氏细胞 螺旋神经节 耳蜗

    ZHANG Yanping1， TANG Wenxue2, LIN Xi2

    (1. Department of Otolaryngology, Second Affiliated Hospital of General Hospital of PLA, Beijing 100091, China；

    2. Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery/Cell Biology, Atlanta, Georgia, 30322, USA)

    Abstract:  Objective   To investigate the expression of connexin29 （connexin 29, Cx29）in mice cochlea and explore the reason why mutation of Cx29 caused deafness. Methods  Adult wild type mice C57 were decapitated and their cochleas were dissected. After a series of preparations, frozen cochlea sections were cut (7?μm). Immunofluorescent labeling and colabeling of Cx29 with neurofilament (NF), myelin associated glycoprotein (MAG) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) were applied to the sections. Labeled samples were observed by a fluorescent microscope.  Results  In  lowmagnification view, Cx29 strongly labeled tracts where the auditory nerve travels inside the cochlea until the border was marked by the glial junction. The stria vascularis was faintly stained. Views obtained at higher magnification showed Cx29 expressed at the myelin of the spiral ganglion neurons and the auditory nerve fibers inside cochleas. Colabeling immunostaining showed MAG expressed in the auditory nerve inside and outside the cochlea and coexpressed with Cx29 only in the auditory nerve inside the cochlea in circular immunostaining patterns. GFAP was  only expressed in the auditory nerve in the brainstem outside the cochlea. There were no coexpressions of GFAP and Cx29. The antibody against neurofilament gave an immunostaining pattern of solid dots which were encircled by Cx29positive pixels. Conclusion  Cx29 strongly expresses in  mice cochlea. It suggested that Cx29 should play an important role in the function of mice cochlea.

    Key words: Connexin29; Myelin; Cochlear Schwann cells; Spiral ganglion neuron; Cochlea

    多细胞生物需要通过细胞之间的联系应对内外环境的刺激以便做出相应的反应，这种联系方式之一就是通过缝隙连接（gap junction, GJ）,细胞间通过GJ交换离子、营养物质和代谢产物。GJ由连接蛋白 (Connexin, Cx)组成，现已发现人类至少有20几种连接蛋白编码基因。目前已经发现Cx26和 Cx30在内耳支持细胞和纤维细胞中表达，上述两种蛋白的基因突变是导致人类的非综合征性聋的主要原因，但有关其他连接蛋白在内耳表达的报道较少。最新研究结果表明，Cx29突变也可导致人发生非综合征性聋［1］，为此本研究探讨Cx29在小鼠内耳的表达情况，旨在为进一步研究Cx29突变致聋的原因提供依据。

    1  材料与方法

    1．1  取材及冰冻切片  野生型C57小鼠10只（购自美国Emory大学实验动物中心），用4%多聚甲醛PBS（Sigma公司）溶液心脏灌注固定，断头，解剖显微镜下解剖出内耳，于4%多聚甲醛PBS溶液中，剔除镫骨，开放前庭窗，并于蜗尖钻孔行耳蜗灌注固定，然后在4%多聚甲醛PBS溶液中4?℃再固定1?h。PBS溶液冲洗标本，置于10%乙二胺四乙酸二钠（disodium ethylenediamine tetraacetate，EDTA）溶液中脱钙72?h，脱钙后的标本20%蔗糖溶液浸泡过夜，后在OCT混合物（optimum cutting temperature compound，OCT）中浸泡过夜，经过上述处理过的内耳放入液氮中约5?s，然后迅速取出，保留在液氮表面的空气中约1?min后取出，平行于蜗轴行7?μm冰冻切片。

    1.2  双重免疫组化染色  冰冻切片用0.1%的TritonPBS处理10?min，5%羊血清室温包被1?h，分别添加神经丝蛋白(neurofilament, NF)5?μg/mL、髓鞘相关糖蛋白抗体（mylein associated glycoprotein, MAG）5?μg/mL和神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）(7.5?μg/mL)抗体与Cx29 (0.625?μg/mL)抗体配对作为一抗4?℃孵育过夜，PBS漂洗6次后，加Cy2或Cy3鳌合二抗室温孵育1?h，SlowFade抗褪色试剂盒封片，内含4′,6二脒基2苯基吲哚(4′,6diamidino2phenylindole Dihydrochloride DAPI)衬染细胞核，结果用光学显微镜(Axiovert 135TV; Carl Zeiss) 或共聚焦显微镜(Zeiss LSM 510)观察。PBS代替一抗作为阴性对照。

    2  结  果

    2.1  Cx29在耳蜗中的总体表达情况  低倍镜下见Cx29在耳蜗中听神经和前庭神经经过通路上大量表达，Corti氏器和前庭囊斑内没有明显表达，在内听道底部以外的脑干部位位听神经没有表达，形成鲜明的神经胶质接缝（glial junction）分界；血管纹处可见微量表达（见封3图1）。结合双重免疫组化染色结果显示Cx29主要表达于耳蜗内的位听神经和螺旋神经节细胞髓鞘。阴性对照上述部位未见荧光染色。

   2.2  双重免疫组化结果  双重免疫染色结果显示，低倍镜下MAG表达于耳蜗内位听神经、脑干处位听神经，Cx29与MAG的共同表达于内耳位听神经处，而在螺旋神经节细胞胞体只有Cx29表达（见封3图2A、图2B），共聚焦显微镜下观察耳蜗内位听神经的横断面，Cx29和MAG在耳蜗内位听神经的表达都呈圈状（见封3图3A1、A 2），与髓鞘的结构相一致，约有(38.6±4.2)%的位听神经共同表达Cx29和MAG（见封3图3A3）。GFAP只在内听道以外的位听神经表达，而在耳蜗中无表达，与Cx29的表达在内听道底神经胶质接缝处形成鲜明分界（见封3图2C），共聚焦显微镜下，放大进一步观察封3图2C的D区，结果显示GFAP与Cx29无共同表达。NF在耳蜗位听神经的横断面上呈点状表达（见封3图3B2），Cx29的染色形成一个个圈样（见封3图3B1）围绕NF（见封3图3B3），共同表达仅占(6.2±2.1%)。阴性对照上述部位未见荧光染色。

    3  讨  论

    小鼠Cx29由GJE1编码，位于小鼠5号染色体远端，蛋白有258个氨基酸，分子量28.981?KD，与人的connexin30.2在基因序列上有75%相同［2］。在小鼠中枢和外周神经系统均有Cx29的表达,但外周神经系统中的表达更为丰富。在中枢神经系统，Cx29只在小型的神经纤维的少突胶质细胞表达［3］，而在成年鼠的坐骨神经中，Cx29主要定位于髓鞘最内层、结旁体、近结旁体和内侧轴系膜，与分布轴索膜上的Kv1.2等钾离子通道相邻［4］6465，可能与钾离子在髓鞘内外的转运有关［4］6466。Li等［5］对野生型和敲基因小鼠的研究表明，Cx29在胚胎12周时在雪旺氏细胞神经嵴前体细胞中表达，提示Cx29可能是一个辨认早期雪旺氏细胞新的标记物，在外周神经的发生和成熟过程中起重要作用。

    为探索Cx29在听觉功能维持中可能的作用，本研究通过冰冻切片、免疫组化技术研究小鼠耳蜗中Cx29的表达，结果显示Cx29在耳蜗中听神经和前庭神经经过通路上大量表达，Corti氏器和前庭囊斑内没有明显表达，在内听道底部以外的脑干部位位听神经没有表达，形成鲜明的神经胶质接缝分界；血管纹处可见微量表达。为了能在光镜水平观察Cx29的亚细胞定位情况，本研究应用几种神经相关蛋白抗体进行多重免疫组化染色，初步确定了耳蜗中Cx29的表达确切位置。选取的抗体包括MAG、GFAP和NF，其中MAG是免疫球蛋白超家族成员，由中枢神经系统的少突胶质细胞和外周神经系统的Schwann细胞表达，定位于直接和轴突相接触的髓鞘膜的最里层［6］；GFAP是星形胶质细胞中的一种标志蛋白，它参与神经元内环境的维持和血脑屏障，仅在中枢神经系统中表达；NF是神经细胞的中间纤维，广泛存在于各种动物的成熟神经元中，轴突中的神经丝互相平行排列。本研究将Cx29与上述几种蛋白共同进行多重免疫组化所得出的结果，Cx29与MAG有约40%的表达重叠，Cx29围绕NF表达，表达上仅有约6%重叠，可以初步确定Cx29在耳蜗位听神经的Schwann细胞中表达，提示可能具体的表达位置在髓鞘的内层，与轴突直接接触。而在中枢神经系统的星形胶质细胞中没有表达。Cx29的敲基因小鼠的研究充分验证了在本研究结果的真实性［7］。

    本研究结果显示，Cx29的分布位于耳蜗Schwann细胞髓鞘内层，紧贴神经纤维，同时在血管纹处也有表达。外周神经结旁体神经纤维与髓鞘紧贴处，为钾离子通道Kv1.1、Kv1.2、Kvβ表达部位，推测Cx29可能参与了轴浆和轴突旁间隙的钾离子转运，可能在神经电活动中为钾离子从轴旁间隙中清除提供了通道，Cx29可能与其他GJ蛋白，如Cx32，一起为钾离子在非致密髓鞘内外穿梭提供了方便［4］6468。钾离子是内耳维持正常功能的重要离子之一，目前钾离子在内耳的代谢机制还不完全清楚，根据Cx29在耳蜗中的表达结果，推测Cx29可能与耳蜗的钾离子代谢也存在一定的关系， Cx29发生突变后，可能引起离子转运受阻，出现内耳功能障碍导致耳聋，因此Cx29对于维持小鼠内耳的正常功能可能起重要作用，但具体机制还需要进一步研究。

【参考文献】［1］ Yang J J, Huang S H, Chou K H， et al. Identification of mutations in members of the connexin gene family as a cause of nonsyndromic deafness in Taiwan［J］. Audiol Neurootol, 2007, 12(3):198208.

［2］ S〖AKo¨D]hl G, Eiberger J, Jung Y T, et al. The mouse gap junction gene connexin29 is highly expressed in sciatic nerve and regulated during brain development［J］. Biol Chem, 2001, 382(6):973978.

［3］ Kleopa K A, Orthmann J L, Enriquez A, et al. Unique distributions of the gap junction proteins connexin29, connexin32, and connexin47 in oligodendrocytes［J］. Glia, 2004, 47(4):346357.

［4］ Altevogt B M, Kleopa K A, Postma F R, et al. Connexin29 is uniquely distributed within myelinating glial cells of the central and peripheral nervous systems［J］. J Neurosci, 2002, 22(15):64586470.

［5］ Li J, Habbes H W, Eiberger J, et al. Analysis of connexin expression during mouse Schwann cell development identifies connexin29 as a novel marker for the transition of neural crest to precursor cells［J］. Glia, 2007, 55(1):93103.

［6］ 顾文莉，陆佩华.髓鞘相关糖蛋白与神经系统的髓鞘发育和轴突生长［J］.生理学进展, 2006，37（3）：243246.

［7］ Eiberger J, Kibschull M, Strenzke N, et al. Expression pattern and functional characterization of connexin29 in transgenic mice［J］. Glia, 2006, 53(6):601611.