地黄益知浸膏对老年性痴呆大鼠海马磷酸化CREB、GSK-3β表达的影响

　　作者：李强 胡长林 王景周 作者单位：重庆医科大学附属第二医院神经内科，重庆 400010

　　【摘要】 目的 观察地黄益知浸膏(Dihuang Yizhi Jingao,DHYZJG)对老年性痴呆(AD)大鼠学习记忆能力及海马组织环磷酸腺苷反应单元结合蛋白 (cyclic AMP response element-binding protein，CREB)、pCREB Ser133、糖原合成酶激酶 (glycogen synthase kinase，GSK)-3β、pGSK-3β Ser9表达的影响，探索其防治AD的可能机制。方法 采用右侧海马注射β淀粉样肽(Aβ)25～35制备AD大鼠模型，用穿梭箱及水迷宫检测其学习记忆能力;应用免疫印迹法测定其CREB、GSK-3β的磷酸化水平。结果 DHYZJG可剂量依赖性地改善AD大鼠的学习、记忆能力;与AD组相比,DHYZJG高剂量组海马pCREB Ser133水平显著增高 (P<0.01),pGSK-3β Ser9水平明显增高(P<0.05)。结论 DHYZJG可明显改善AD大鼠认知功能障碍,其机制可能与其上调海马CREB、GSK-3β蛋白的磷酸化水平有关。

　　【关键词】 地黄益知浸膏;老年性痴呆;环磷酸腺苷反应单元结合蛋白(CREB);糖原合成酶激酶(GSK)-3β

　　老年性痴呆(AD) 属于一种起病隐匿的进行性发展的痴呆，是痴呆中最常见的一种进展性脑变性疾病。淀粉样蛋白沉积、神经纤维缠结、神经元丢失是AD的主要病理改变。近年来发现，环磷酸腺苷反应单元结合蛋白 (cyclic AMP response element-binding protein,CREB) 是细胞内多种信号通路的一种关键成分，其蛋白磷酸化水平的变化可影响神经元突触可塑性和神经网络的形成〔1，2〕。糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK) -3β是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,其广泛存在于各种细胞中,参与多种信号转导通路调节,在Tau蛋白磷酸化调节中起非常重要的作用 〔3〕。体外研究表明Aβ可明显抑制培养的海马神经元中的长时程增强电位及PKA/CREB介导的信号转导途径，激活GSK-3β并以GSK-3β依赖的方式引起神经元丢失〔4，5〕。地黄益知浸膏(Dihuang Yizhi Jingao，DHYZJG)是采用重庆名中医王辉武教授提供的验方所制,在临床治疗中具有改善和延缓AD认知衰退的作用。目前,DHYZJG对AD尤其是其信号转导通路的作用机制尚不清楚。本研究旨在以淀粉样蛋白级联假说为切入点,观察DHYZJG是否能调节AD大鼠行为学及海马CREB、GSK-3β蛋白的磷酸化水平，探讨DHYZJG是否通过改善脑组织神经元存活信号途径的功能以及蛋白激酶/蛋白磷酸酯酶磷酸化系统失衡而发挥治疗AD的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物分组 Wistar大鼠，雄性96只,体重(250±20)g,第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供，清洁级。经穿梭箱训练粗筛后,淘汰6只，随机均分为假手术组、模型组、DHYZJG 低、中、高剂量组、多奈哌齐(Donepezil)组,每组15只。DHYZJG由熟地黄、山茱萸、石菖蒲、远志、巴戟天等8味中药(重庆汉邦天然药业有限公司)组成,重庆中药研究所鉴定为纯正中药材,并由该研究所经水煮醇提法,制成中药流浸膏(1 g流浸膏相当于2 g生药含量)。置0～4℃ 冰箱保存。在实验前对DHYZJG流浸膏进行毒理实验,LD50>50 g(生药)/kg。

　　1.2 方法

　　1.2.1 主要试剂与仪器 多奈哌齐由卫材(中国)药业有限公司提供;CREB 抗体，pCREBSer133抗体、pGSK-3βSer9抗体均为Cell Signaling公司产品;GSK-3β抗体购自北京博奥森试剂公司;Aβ25～35为首都医科大学宣武医院多肽室提供;β-actin抗体均为Santa Cruz公司产品;凝胶扫描成像系统(Bio-Rad公司，美国);电脑控制的穿梭箱系统(第三军医大学大坪医院野战外科研究所)、大鼠脑立体定位仪(江湾Ⅰ型);水迷宫(重庆医科大学儿童医院研究所)。

　　1.2.2 模型制备 大鼠用1%戊巴比妥钠(45～50 mg/kg) 腹腔注射麻醉后，固定大鼠于脑立体定位仪上定位海马(前囟后3.3 mm,中线旁开2 mm,硬脑膜下2.7 mm),持微量进样器自脑表面垂直进针,于10 min内缓慢将Aβ25～35(5 μg/μl )2 μl 注入,留针15 min,缓慢退针。所有操作均在无菌条件下进行。皮肤切开处用青霉素抗菌,缝合伤口。常规饲养;假手术组注入2 μl生理盐水,其余步骤同前。手术过程中注意保持大鼠呼吸道通畅,术后注意保持其体温。注射前,用灭菌生理盐水将Aβ25～35稀释,37℃孵育1 w，使其变为聚集状态。

　　1.2.3 给药方法 造模后次日进行穿梭箱检查。证实造模成功后开始灌胃(其中，造模中死亡2只;DHYZJG 高、中剂量组两组在灌胃中分别死亡2和3只)。大鼠给药剂量:DHYZJG高、中、低剂量组分别按照22、11、5.5 g (生药)·kg-1·d-1，以5 g/L羧甲基纤维素钠制成均匀混悬液灌胃，多奈哌齐组给予多奈哌齐0.92 mg·kg-1·d-1灌胃，假手术组、模型组给予等量灭菌生理盐水灌胃。每日1次,连续4 w。各组动物在实验过程中随时按以上操作补上死亡的大鼠数。

　　1.2.4 检测指标

　　1.2.4.1 学习记忆功能检测 ①电脑控制的穿梭箱实验，采用微机控制的穿梭箱主动回避反应系统。大鼠的学习记忆能力以完成主动回避反应(Active avoidance reaction，AAR)的次数与测试总次数(20次)的比值即AAR习得率代表。本实验各组大鼠在造模前，均以穿梭箱测试进行粗筛,AAR习得率≥80%者入选。在AD模型制备后1 d及治疗4 w后分别进行穿梭箱测试。②水迷宫实验，各组大鼠在药物干预结束后开始水迷宫检测。以水箱中心为原点将其分为N、S、E和W 4个象限。测试时其入水点在4个象限随机选取。记录2 min内游上平台所需时间(逃避潜伏期)。每次大鼠游上平台,待其停留30 s后再进行下一次实验。若大鼠入水后2 min内未能找到平台，则将其置于平台上并停留30 s，逃避潜伏期记录为120 s。每只大鼠每天测验8次,连续 5 d。在上述检测完，各组大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射,于麻醉状态下断头,冰上快速分离右侧海马,立即将其置入液氮中冻存待测。

　　1.2.4.2 海马CREB、pCREBSer133、GSK-3β及pGSK-3βSer9含量的检测 采用Western印迹方法：取海马脑组织约70 mg，在冰上按每mg组织10 μl的比例加入预冷提取缓冲液(Tris-HCl:50 mmol/L，pH 8.0,NP-40：1%，脱氧胆酸钠0.25%,NaCl:150 mmol/L,EDTA：4 mmol/L，EGTA：2 mmol/L，PMSF:2 mmol/L，抑肽酶、亮肽酶素、胃酶抑素各:5 mg/L,激活的Na3VO4:1 mmol/L,NaF:50 mmol/L)，匀浆后在12 000 r/min、4℃离心25 min，收集上清。分装保存于-20℃待用。用BCA法进行蛋白定量。40 μg蛋白上样，经10%SDS-PAGE电泳分离，电泳条件：4℃，电流20～30 mA。电泳结束后， 转印到硝酸纤维素(NC)膜上，转膜条件：4℃，电流400 mA，转膜3 h。Western印迹杂交步骤如下：于室温用5%脱脂奶粉封闭NC膜2 h，TTBS缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5;0.15 mmol/L NaCl;0.05% Tween20)漂洗3次，每次10 min，分别加一抗CREB(1∶1 000)、pCREBSer133 (1∶1 000)、GSK-3β(1∶500)、pGSK-3βSer9 (1∶1 000)，37℃孵育1 h，后4℃过夜;TTBS漂洗同前。再将NC膜加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，37℃振荡孵育2 h，TTBS漂洗同前。加入ECL试剂反应5 min，保鲜膜包裹，暗室进行X-光胶片曝光、显影和定。以β-actin (1∶2 000)作为内参对照。上述实验重复3次。参照文献〔6〕，将所得的实验结果经Gel Doc凝胶成像分析系统扫描，Band-scan5.0凝胶电泳图像分析软件对结果进行半定量分析。

　　1.3 统计学处理 数据用x±s表示，应用统计软件SPSS10.0处理。水迷宫数据采用重复测量数据的多因素方差分析;穿梭箱实验数据采用t检验;Western 印迹结果采用One Way ANOVA分析。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠穿梭箱成绩的变化 与其造模前相比，除假手术组外其他组在造模后治疗前AAR习得率显著降低(P<0.01);在治疗4 w后,与假手术组比较,模型组AAR习得率显著降低(P<0.01);与模型组比较，DHYZJG 高剂量组AAR习得率显著升高(P<0.01)，中剂量组AAR习得率明显升高(P<0.05),而低剂量组AAR习得率无显著差异(P>0.05)，多奈哌齐组AAR习得率显著升高(P<0.01)。见表1。

　　2.2 各组大鼠水迷宫逃避潜伏期的变化 随着训练天数的延长,各组大鼠的平均逃避潜伏期总体呈逐渐下降趋势。前2 d虽下降明显，但各组间比较差异无显著性。从第3天开始，模型组大鼠平均逃避潜伏期较假手术组明显延长(P<0.01);DHYZJG 高剂量组和多奈哌齐组大鼠平均逃避潜伏期较模型组明显缩短(P<0.01)，而与假手术组比较差异无显著性(P>0.05)。见表2。

　　表1 各组大鼠AAR习得率变化(略)

　　与假手术组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05;与造模前比较：4)P<0.01;下表同

　　表2 各组大鼠平均逃避潜伏期(略)

　　2.3 各组大鼠海马CREB、pCREB Ser133的表达变化 Western印迹结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠海马总CREB蛋白表达虽有所下降，但无显著差异(P>0.05)，模型组海马的pCREB Ser133蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组相比,DHYZJG高剂量组海马pCREB Ser133蛋白表达显著增高(P<0.01)，多奈哌齐组海马pCREB Ser133蛋白表达明显增高(P<0.05)。作为对照的β-actin含量在各组表达未发生显著变化(P>0.05)。见图1。

　　2.4 各组大鼠海马GSK-3β、pGSK-3β Ser9的表达变化 Western印迹结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠海马总GSK-3β蛋白表达无明显差异(P>0.05)，pGSK-3βSer9蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组相比，DHYZJG高剂量组总GSK-3β蛋白表达明显下降(P<0.05)，多奈哌齐组总GSK-3β蛋白表达无明显差异(P>0.05),DHYZJG 高剂量组、多奈哌齐组pGSK-3βSer9蛋白表达均明显增高(P<0.05)。作为对照的β-actin含量在各组表达未发生显著变化(P>0.05)。见图1。

　　图1 各组大鼠海马CREB和GSK-3β磷酸化水平变化的Western印迹检测结果(略)

　　3 讨论

　　由于AD发病机制复杂，单一作用点药物很难取得满意效果，目前仍缺乏有效的防治药物，临床主要用胆碱酯酶抑制剂,但也只能改善早、中期患者的部分症状。而中医药不但在缓解衰老及衰老相关疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验，且其还具有多途径、多方式、多靶点特征，具有明显的优越性。《类证治裁》曰:“夫人之神宅于心，心之精根于肾，而脑为元神之府，精髓之海，实记忆之所凭也。”认为AD发病主因是肾精气衰减，元气亏虚，精血化生不足而造成的。故其治疗尤以补肾填精为主。目前在临床上以熟地黄为君药治疗AD的中成药甚多,都有程度不同的效果。但对其治疗AD的机制尚未阐述清楚。DHYZJG中的熟地黄、山茱萸、石菖蒲、远志、巴戟天等具有补肾、益气、生髓、养脑作用。本实验结果提示DHYZJG可使AD大鼠学习记忆障碍呈剂量依赖性的改善，DHYZJG 高剂量和多奈哌齐均具有改善模型大鼠学习记忆功能的作用。

　　CREB是一种具有选择性特异结合cAMP反应元件(CRE)的核蛋白，由341个氨基酸残基组成,分子量43 kD。CREB主要通过Ser133处被磷酸化而激活,引起即刻早期基因和晚期反应基因包括Bcl-2、脑源性神经生长因子等下游靶位的表达,进而促进神经元的存活,维持突触功能〔7〕。研究发现CREB是长时程记忆和长时程增强效应的必要基因开关。Francis等〔8〕观察敲除早老素1、2基因小鼠的大脑皮层发现，CREB结合蛋白水平及CREB相关的基因表达下调，而该下调可促进后继的神经元退行性改变。本研究表明模型组大鼠由于Aβ的刺激,影响了CREB磷酸化过程,引发认知功能减退。亦提示DHYZJG可能通过显著上调AD大鼠海马组织CREB的磷酸化水平,改善AD中枢神经系统信号转导功能紊乱,而启动与存活相关基因的转录,调节突触可塑性,增强长时程增强效应等，最终使AD的认知功能障碍有所好转。

　　Tau蛋白过度磷酸化是AD发病机制中的重要环节。正常的Tau蛋白可稳定神经元的细胞支架;反之，过度磷酸化的Tau蛋白则干扰神经元微管及神经元内细胞器的转运，最终导致神经元及其突触功能的紊乱。GSK-3β是引起Tau蛋白磷酸化的关键性蛋白激酶，其活性受丝氨酸和酪氨酸磷酸化的调节。Ser 9位点的磷酸化下调GSK-3β的活性〔9〕。离体研究表明，凝聚态的Aβ1～40或其活性片段Aβ25～35能使原代培养的海马神经元Tau蛋白在特定位点的磷酸化增多，并且证实其是通过激活GSK-3β而不是GSK-3α起作用〔10〕。Li等〔11〕研究发现在过度表达人GSK-3β(Ser9突变)的转基因小鼠模型中，其皮层、海马总GSK-3β的含量同月龄相匹配的正常小鼠相比并未发生显著改变，但在相应部位处于发生神经纤维缠结前状态的神经元则可导致Tau蛋白的高度磷酸化。我们实验结果提示Aβ25～35可通过激活GSK-3β而引起AD大鼠Tau蛋白的过度磷酸化;与模型组相比，DHYZJG高剂量组、多奈哌齐组pGSK-3βSer9蛋白表达均明显增高;但是DHYZJG 高剂量组可使总GSK-3β蛋白表达明显下降,而多奈哌齐组则无明显差异。因此，DHYZJG 与多奈哌齐可能都通过抑制GSK-3β活性而减少AD大鼠过度磷酸化的Tau蛋白。但二者又有所不同，即DHYZJG 还可通过减少AD大鼠海马GSK-3β蛋白的含量来减少其过度磷酸化的Tau蛋白;DHYZJG可能通过除了提高海马乙酰胆碱含量以外的其他途径减少GSK-3β的表达,其机制有待进一步研究。本研究结果也体现了DHYZJG治疗AD的多靶点、多途径的优势。

　　【参考文献】

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