江苏南通地区非综合征性耳聋GJB2基因突变分析

作者：尤易文　崔敬红　作者单位：1　江苏省南通大学附属医院耳鼻咽喉科 （江苏　226001） 《中华耳科学杂志》2007年3月5卷1期 聋病基因研究 【摘要】目的　研究南通地区非综合征性耳聋GJB2基因突变情况。方法　收集南通地区海安县和如皋县聋哑学校学生100名和健康对照组50名， 利用PCR扩增及限制性内切酶酶切分析初筛GJB2 235delC突变者，然后再行DNA直接测序。 结果　耳聋组中共发现三种突变： 235delC、 176-191del16、 299-300delAT。235delC是主要突变方式， 约30％ 的患者携带此突变； 299-300delAT和176-191del16突变检出率分别为9％和8％。对照组未发现这些突变。结论　南通地区非综合征性耳聋GJB2基因突变率较高， 因此在南通地区进行广泛的生育前耳聋基因筛查工作有重要意义。 【关键词】  非综合征性耳聋；　GJB2基因；　基因突变　　随着人们对耳聋基因的逐步认识，与常染色体隐性遗传性耳聋（DFNB）有关的分子遗传学分析为耳鼻咽喉科学家确定耳聋的病因提供了关键工具。过去五年中听力障碍的遗传学知识得到飞速发展。1997年以前， 还没有与非综合征性聋有关的基因被克隆，而目前已报道与常染色体隐性非综合征性耳聋（ARNSHI）有关的基因32个， 其中研究较多的基因是GJB2基因， 由GJB2基因突变造成的耳聋在遗传性耳聋中约占50％，而且该基因短小， 编码区678 bp，  因此可以利用其发病率高、 基因小的特点， 进行基因筛查和基因诊断。 自2004年起解放军总医院聋病分子诊断中心开始了全国性的聋病分子流行病学调查，这次与我院合作对江苏南通地区进行耳聋流行病学及分子病因学研究，先期已报告202例聋哑学生中195例非综合征性耳聋患者的GJB2 235delC热点突变筛查结果， 其突变检出率达到26.7%[1]， 在全国处于较高水平。为进一步调查南通地区聋哑学生中GJB2基因的其他突变情况， 确定这一地区聋哑患者的GJB2突变的总体情况， 我们选择了其中100例非综合征耳聋患者进行了GJB2全基因序列分析， 现将结果报告如下。    1　资料与方法    1.1　资料收集    1.1.1　病例选择　所选对象分别来自江苏南通地区海安县和如皋县聋哑学校全部参与检测的学生， 共104名， 包括散发病例97名， 7个家系的先证者7例。其中男性51名， 女性53名， 年龄6岁 ～ 19岁， 平均年龄12岁， 均是汉族。采用问卷调查形式， 调查表内容由聋儿基本信息、 耳聋史、 家族史、 聋儿出生史、个人史（聋前传染病、 耳毒性药物应用情况、头部是否受外伤等）、 体检（全身及专科查体）等部分组成。对全部研究对象由专业人员进行纯音测听检查，均为重度感音神经性聋。    1.1.2　对照组　共50名， 由解放军总医院聋病分子诊断中心提供。    1.2　方法

    1.2.1　DNA提取方法

    　　采集受检者外周血3 ～ 5 ml，应用试剂盒提取DNA（上海华舜生物工程有限公司）， 提取步骤参照试剂盒提供的使用说明进行。 取提取的DNA适量，用紫外分光光度计进行定量和纯度检测， 其余保存于-70℃ 备用。

    1.2.2　PCR扩增及限制性内切酶酶切分析： GJB2 235delC突变检测方法见戴朴论文［2］。

    1.2.3　直接测序法： 进行PCR扩增， PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后， 送北京华大中生科技发展有限公司直接测序。测序结果通过GENETOOL软件进行分析。

    2　结　果

    2.1　病史资料　参与调查的聋哑学生中， 散发病例97名， 其中93例为非综合征性耳聋患者（排除中耳疾病； 排除脑炎、 脑膜炎、 腮腺炎等病史； 排除母孕期异常和出生时乏氧及早产等病史；无智力障碍； 聋前无明确头部外伤史）； 家系的先证者7例均为非综合征性耳聋患者， 家系图见图1。发病年龄主要集中在婴幼儿时期， 最早发病是在出生后1个月， 最晚在6岁。

  2.2　限制性内切酶酶切结果

  93例散发病例中12例存在GJB2 235delC纯合突变； 16例存在GJB2 235delC杂合突变。7例家系中2例为GJB2 235delC杂合突变。 正常对照中未发现235 delC突变（见图2）。

   2.3　直接测序结果 （表1）

   直接测序证实了酶切结果GJB2 235delC纯合突变12例；而GJB2 235delC杂合突变者中5例与299-300delAT组成复合杂和突变， 4例与176-191del16组成复合杂和突变； 1例176-191del16 纯合突变； 2例是299-300delAT和176-191del16 杂和突变； 12例仅有一个突变位点， 未发现等位基因突变位点。两个携带235delC杂合突变家系中1例发现另一个299-300delAT杂和突变， 另1例仅有一个突变位点。正常对照组未见致病突变（见图3）。

    3　讨　论

   大约1/1 000新生儿有明显的听力障碍， 其中感音神经性聋是最常见的类型。50％ 的先天性重至极重度听力障碍被认为是遗传性的， 根据孟得尔式遗传方式， 遗传性聋可分为常染色体隐性（大约80％）、常染色体显性 （18％） 和X连锁 （2％）。遗传性聋可以进一步分为综合征性和非综合征性聋。在过去的十年中综合征性及非综合征性聋的发病机理研究得到快速发展，最有临床意义的发现是定位于DFNB1的GJB2突变在许多国家都是重度语前聋的重要原因， 但其突变热点有明显的种族特异性。

   南通地区共检出3种突变形式： 235delC、 299-300delAT、 176-191del16， 说明南通地区耳聋患者的GJB2突变谱比较单纯，三种突变均是中国人耳聋的常见突变[３]。100例受检耳聋患者中，通过ＡpaI酶切法快速分析可以发现或揭示30例GJB2耳聋患者，但会漏诊6例携带299-300delAT、176-191del16突变而没有同时携带235delC突变的病例，反映出235delC突变的快速筛查在这一地区可以发现83.3% GJB2耳聋， 但最终的临床诊断还有赖于GJB2基因的全序列分析。本研究没检测到30delG（35delC）和167delT， 目前认为30delC（35delC）是欧美人群中隐性遗传耳聋的突变热点之一，在日本及中国等亚洲人群中则很少检测到35delC突变；167delT多在犹太人群中发现， 而且该位点也是犹太人中最常见的突变，其他人群未发现此型突变［4］。

   233-235delC突变是在编码区235处缺失、造成移码突变， 使得终止密码提前至82号， 翻译出含81氨基酸的多肽，比野生型Cx26蛋白截短了145个氨基酸。据报道在亚洲人群中235delC是主要突变形式。 日本Kudo和Abe［  5, 6］、 韩国Choung［7］及泰国的资料［8］等均报道GJB2突变频率高。在国内， 解放军总医院聋病分子诊断中心已经开展的全国性聋病分子流行病学调查表明GJB2 235delC突变所致耳聋比例为18.5%。本文的数据显示南通地区93例散发病例中有28例235delC突变（占30.1%），家系的先证者7例中2例存在235delC突变（占28.5%）。

   同时本文的研究发现100例测序样本中9例存在299－300delAT杂和突变（占9％）， 8例176-191del16突变（占8％）。299－300位点AT缺失导致Cx26基因从100号密码子后编码13个新的氨基酸， 终止密码提前至113号，翻译的多肽只有112个氨基酸，比野生型蛋白的226个氨基酸截短了l14个， 且只有前99个氨基酸与野生型相同。 国内肖自安［9］ 等报道在1个常染色体显性遗传性聋家系的3名患者发现此杂和突变。176-191del16指176位后16个碱基丢失， 从59号密码子开始移码， 使得终止密码提前至75号， 产生无功能的蛋白质。国内郑文波［3］ 等报道2例此突变。 日本Kudo［5］等报道2例， 未统计突变率。

   另外直接测序显示12例GJB2杂和突变仅有一个突变位点，未发现等位基因突变位点， 分析原因可能是除了GJB2外还存在其它基因突变。最近报道GJB6基因（编码Cx 30）突变与GJB2杂合突变患者有关。这两个基因都表达于内耳，与遗传性聋有关，共同位于13p12区域， 对于定位在此区域的耳聋家系， 在GJB2没有发现突变时， 就应该考虑在这个区域还有另外一个耳聋基因。Lerer［10］报道在七个犹太人家庭内存在GJB6基因的大片段缺失， 同时要么伴有GJB2 167delT杂合突变，要么伴有GJB2 35delC杂合突变。作者假定这种缺失的作用是GJB2和GJB6基因的交替遗传，或是可以影响GJB2表达的控制因子。南通地区GJB2突变率相对较高，其他基因突变率是否也较高呢？这有待于我们进一步研究证实。

　南通市位于江苏省东部、 长江入海口北岸， 三面环水， 形同半岛， 管辖县区内流动人口相对较少，婚配习惯主要是当地人间通婚， 故致聋基因易代代相传下去。本研究发现在南通聋哑学生群体中GJB2基因突变检出率较高（36％）， 因此在南通地区进行广泛的生育前耳聋基因筛查工作（包括重点人群和普通人群）， 建立了耳聋基因诊断已明确的患者和家系的档案， 按照遗传学检测数据进行分类， 应用不同的策略进行优生优育指导和耳聋预防实践， 是达到减少聋儿出生这一目标的重要途径。

【参考文献】1　崔敬红， 尤易文， 戴朴， 等. 南通地区遗传性耳聋资源收集及病因学分析. 中华耳科学杂志， ２００６， ４（1）：27-29.

2　戴朴,于飞,康东洋,等.线粒体DNA1555位点和GJB2基因及SLC26A4基因的诊断方法及临床应用. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2005, 40(10): 769-773.

3　郑文波， 罗建洪， 郧云， 等． 中国人语前非综合征性耳聋患者GJB2基因的突变分析． 中华儿科杂志， 2000， 38（10）： 610-613.

4　Kenneson A, Van Naarden Braun K, Boyle C. GJB2（connexin 26） variants and nonsyndromic sensorineural hearing loss: a HuGE review. Genet Med, 2002, 4(4): 258-274.

5　Kudo T， Ikeda K， Kure S， et a1． Novel mutations in the connexin 26 gene（GJB2） responsible for childhood deafnees in the Japanese population． Am J Med Genet， 2000， 90(2)：141-145．

6　Abe S， Usami S． Shlnkawa H， et aL. Prevalent connexin 26 gene(GJB2) mutations in Japanese． J Med Genet, 2000， 37（1）： 41-43.

7　Choung YH, Moon SK, Park HJ. Functional study of GJB2 in hereditary hearing loss. Laryngoscope, 2002, 112(9): 1667-1671.

8　Kudo T, Ikeda K, Oshima T, et al. GJB2 (connexin 26) mutations and childhood Deafness in Thailand. Otol Neurotol, 2001, 22(6): 858-861.

9　肖自安， 冯勇， 潘乾，等. 非综合征性耳聋患者连接蛋白26基因突变的研究. 中华耳鼻咽喉科杂志， 2000， 35(3)： 188-191.

10　Lerer I, Sagi M, Ben-Neriah Z, et al. A deletion mutation in GJB6 cooperating with a GJB2 mutation in trans in non-syndromic deafness: A novel founder mutation in Ashkenazi Jews. Hum Mutat， 2001, 18（5）: 460.