ALOX5AP基因突变与缺血性脑卒中的关系

ALOX5AP基因突变与缺血性脑卒中的关系作者：高强，杨春晓，慕璐岩，张双彦，梁庆成　    作者单位：150086 哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科（高强，杨春晓，梁庆成）；哈尔滨医科大学附属第四医院神经外科（慕璐岩）,神经内科（张双彦）    【摘要】  目的 探讨ALOX5AP基因突变与缺血性脑卒中的关系。方法 采用聚合酶链反应单链构象多态性法及双脱氧末端终止法分析26例急性脑梗死患者及23名正常对照者的ALOX5AP基因的单核苷多态性(SNPs)。结果 脑梗死组出现ALOX5AP基因SG13S100杂合型(A/G)（18例,69.2％）的频率显著高于正常对照组（8人,34.8％）（P<0.05）。男性脑梗死患者ALOX5AP基因SG13S100杂合型(A/G)的频率（86.7％）明显高于女性患者（45.5％）（P<0.05）。结论 ALOX5AP基因突变与缺血性脑卒中的发生有关, 急性脑梗死患者ALOX5AP基因SG13S100的突变率显著增高，其中男性患者尤为明显。    【关键词】  ALOX5AP； 缺血性脑卒中；基因    Relationship between mutations in the ALOX5AP gene and ischemic stroke  GAO Qiang, YANG Chunxiao, MU Luyan, et al. Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086,China    Abstract：Objective  To investigate the association between the mutations in the ALOX5AP gene and ischemic stroke.Methods  In 26 patients with acute cerebral infarction and 23 normal controls, the mononucleoside polymorphism (SNPs)  in the ALOX5AP was analysised by the single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products (PCRSSCP) and Sanger’s dideoxy chain termination.Results  The frequency of SG13S100(A/G) in the ALOX5AP gene in group of cerebrall infarction(18/26, 69.2％) was significantly higher than that in normal controls(8/23, 34.8％)(P<0.05). And it was obviously higher in male patients(86.7％)than that in female(45.5％) (P<0.05). Conclusion  The ALOX5AP gene is associated with ischemic stroke.  The mutation rate of SG13S100 (A/G) in the ALOX5AP of patients with acute cerebral infarction  increase significantly, especially in male patients.    Key words：ALOX5AP;ischemic stroke;gene　  近年来，随着对脑卒中研究的不断深入，其发病与遗传趋势关系逐渐引起人们的重视。Helgadottir等［1］对冰岛296个家族的713例心肌梗死（MI）患者进行了基因检查，检测出一个可能参与MI和脑卒中的基因ALOX5AP。目前，国内对于该基因在脑卒中发病中的研究鲜有报道。为此，本研究对26例急性脑梗死患者的ALOX5AP基因进行了检测，以探讨该基因突变与脑梗死的关系。1  对象与方法    1．1  对象  （1）脑梗死组：系2005年2～10月间住我院的急性脑梗死患者26例，均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经头颅 CT 或 MRI 确诊。男15例，女11例；年龄35～76岁，平均（52.4±15.2）岁;病程均<10 h。（2）正常对照组：为无遗传病史、无亲缘关系的23名健康人，家族三代以内成员中没有脑血管疾病患者，男14名，女9名；年龄28～70岁，平均（49.7±18.3）岁。在年龄和性别构成比上，两组具有可比性。    1．2  方法    1．2．1  基因组DNA的提取  在每位受检者知情同意后，清晨空腹采集静脉血3 ml，枸橼酸钾抗凝，采用常规盐析法分离白细胞，抽提人基因组DNA。    1．2．2  ALOX5AP基因检测    1．2．2．1  引物的设计  引物设计采用网页界面的Primer 3.0，其上游引物S100F序列为: 5′ATT TCC AAA GGC TTC ACC TCT3′，下游引物S100R序列为：5′CAC TCT TGC ACT TGA CTG TCC3′。    1．2．2．2  DNA目的片段的体外扩增  采用聚合酶链反应单链构象多态性法（PCRSSCP）。PCR反应体系为： 10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，上下游引物各0.3 μl，Taq酶0.2 μl，模板1 μl，Mg2+ 1.5 μl，共计25 μl。采用Touch down PCR方法，反应条件：cDNA预变性：96℃ 2 min。PCR扩增：（1）Touch down循环： 变性 94℃ 30 s，退火 63℃ 1 min（此处温度每进行一个循环将下降0.5℃），延伸 72℃ 40 s，共计10个循环；（2）主循环：变性 94℃ 30 s，退火58℃ 1 min，延伸 72℃ 40 s，共计30个循环；最后延伸 72℃ 5 min，于4℃保存。    1．2．2．3  PCR产物测序  将PCR产物抽样放在2.0%琼脂糖凝胶上，电泳鉴定后，经虾碱性磷酸酶（SAP）和外切酶（Exo I）纯化。采用双脱氧末端终止法(Sanger法)进行PCR产物的目标片断DNA测序。测序反应产物在ABI377 Automatic Sequencer(ABI Biosystem)上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。    1．2．3  等位基因SNPSG13S100位点搜寻  将自动测序仪（Sequence Analysis 3.3）分析所产生的图形文件传至带有Phredphrap、Polyphred和Consed软件的UNIX主机上。通过Polyphred软件进行SNP位点的筛查，然后再人工分析校正。    1．2．4  统计学方法  数据处理采用SPSS 13.0统计软件，组间基因突变率比较采用χ2检验。2  结  果    2．1  PCR反应产物电泳结果  脑梗死组及正常对照组的PCR反应产物电泳后，均在500 bp碱基附近见到单一条带，其长度与ALOX5AP基因中包含SNPSG13S100位点的目的片段相一致。    2．2  ALOX5AP基因中目的片段DNA测序结果  正常ALOX5AP基因的SNPSG13S100位点第61位碱基是鸟嘌呤（G）或腺嘌呤（A），表现为单峰，峰值较高。发生突变的ALOX5AP基因SNPSG13S100位点第61位碱基表现为A/G杂合型，为A/G的杂合双峰，峰值较低。    2．3  脑梗死组与正常对照组ALOX5AP基因SNPSG13S100位点基因突变率比较  脑梗死组中ALOX5AP基因SNPSG13S100位点发生基因突变为18例（69.2％），正常对照组为8例(34.8％)，两组突变率的差异具有统计学意义（P<0.05）。    2．4  不同性别脑梗死患者ALOX5AP基因SNPSG 13S100位点基因突变率的比较  脑梗死组男性患者发生突变为13例（86.7%），女性患者发生突变为5例（45.5%），男女患者基因突变率差异有统计学意义（P<0.05）。3  讨  论    最近，国外学者［2］在针对冰岛MI患者的研究中发现了与心、脑血管疾病相关的基因ALOX5AP，其位于染色体的13q1213，包含5个外显子、4个内含子，长度为31 kb。该基因编码5脂氧合酶激活蛋白(FLAP),与脑卒中相关的SNPs位点共有5个：SNPSG13S25、SNPSG13S32、SNPSG13S89、SNPSG13S100和SNPSG13S114［2］，而后二者尤为重要。目前对SNPSG13S100位点的研究，国内尚无相关报道。本研究通过PCRSSCP及Sanger法对SNPSG13S100位点中的突变碱基进行搜索，通过对DNA测序图的分析发现，正常ALOX5AP基因的SNPSG13S100中第61位碱基是G或A。当该位置碱基发生突变时表现为A/G杂合型，此时电泳图形显示为A/G的杂合双峰而不是纯合单峰，峰值也较A或G时的单峰低。因此可以认为SNPSG13S100的突变点就是第61位碱基，其突变型为A/G杂合型。    本研究中脑梗死患者ALOX5AP基因SNPSG13S100位点的突变率（69.2％）较正常对照组（34.8%）明显升高（P<0.05）。本组该基因的突变率为69.2%，国外资料［35］显示冰岛MI患者此基因的突变率为29.1%，而英国脑卒中患者的突变率略高于此，为33.4％。这种A/G杂合的表型可能使其编码产物FLAP的活性增高，进而使花生四烯酸代谢过程中需要的一种重要的限速酶——5脂氧合酶（5LO）活性也随之增高。因为在完整的细胞中，5LO要发挥其完整的酶功能必须与FLAP结合。二者活性的改变最终使花生四烯酸大量代谢，白三烯的含量明显增高。因白三烯是重要的促炎因子，可激活白细胞、促进单核细胞与血管内皮的黏附，增加血管通透性等，导致血管炎和动脉粥样硬化的发生。在动物模型［6］和人［7］的动脉硬化研究中也发现细胞膜上FLAP和5LO的表达均增加,这也进一步证明了这个结论。随着动脉粥样硬化的进展，最终导致血管壁增厚、损坏和破裂［8］，这个过程包括红细胞通过内皮屏障渗出，中性粒细胞、巨噬细胞、血小板的激活和各种细胞因子、趋化因子的释放，从而使大脑局部供血不足或中断而导致脑卒中。    通过以上分析显示ALOX5AP基因变异的直接结果是增加了5LO的活化，而5LO蛋白是炎性介质白三烯产生过程的一个调节点。其活化的最终结果是导致白三烯增多，而炎性介质的增多又是脑卒中发病的一个重要原因。可见5LO是脑卒中发病过程中必不可少的因素之一。因此，ALOX5AP基因SNPSG13S100位点的基因变异可能是脑卒中的危险因素。本研究结果还显示SG13S100位点的杂合型 (A/G)与男性患者的关系较女性患者更为密切，这与国外的研究结果一致,但对其具体机制尚不清楚。    当前已知脑卒中的危险因素有高血压、高血脂、心脏病、糖尿病及高同型半胱氨酸血症［9］。本研究从遗传学的角度发现ALOX5AP基因突变也是脑卒中发病的一个危险因素,这可能为脑卒中的预防和治疗提供了广阔的前景。【参考文献】  ［1］Helgadottir A, Manolescu A, Thorleifsson G, et al. The gene encoding 5lipoxygenase activating protein confers risk of myocardial infarction and stroke［J］. J Nat Genet, 2004,36:233.  ［2］Lohmussar E, Gschwendtner A, Mueller J, et al. ALOX5AP gene and the PDE4D gene in a Central European population of stroke patients［J］. J Stroke, 2005, 36:731.  ［3］Pritchard JK, Cox NJ. The allelic architecture of human disease genescommon diseasecommon variant or not［J］? Hum Mol Genet,2002,11:2417.  ［4］Clark AG. Finding genes underlying risk of complex disease by linkage disequilibrium mapping［J］. J Curr Opin Genet Dev,2003;13:296.  ［5］Botstein D, Risch N. Discovering genotypes underlying human phenotypes:past success for mendelian disease, future approaches for complex disease［J］. J Nat Genet, 2003,33(Suppl):S228.  ［6］Mehrabian M,Allayee H,Wong J, et al. Identification of 5lipoxygenase as a major gene contributing to atherosclerosis susceptibility in mice［J］. J Cic Res, 2002, 91:120.  ［7］Spanbroek R. Expanding expressing of 5lipoxygenase pathway within the arterial wall during human atherosclerosis［J］.Pro Natl Acad Sci USA,2003,100:1238.  ［8］Libby P. Inflammation in atherosclerosis［J］. J Nature,2002, 420:868.  ［9］李振英,朱惠平,刘力,等.同型半胱氨酸与脑血管病相关因素的分析［J］.临床神经病学杂志,2006,19:37.