儿童和青少年血浆自然发生的抗β淀粉样蛋白抗体的表达
发表时间：2009-11-19 浏览次数：735次
儿童和青少年血浆自然发生的抗β淀粉样蛋白抗体的表达作者：徐武华 作者单位：510515广州,南方医科大学附属南方医院神经外科 【摘要】 目的 探讨自然发生的抗β淀粉样蛋白（Aβ）抗体在儿童和青少年血浆中的表达。方法 将28名1～30岁的健康人群按10岁为1个年龄段分为3组，采用转基因动物模型、组织淀粉样斑块免疫活性（TAPIR）分析和免疫印迹法，分析各组血浆抗Aβ抗体的存在和免疫特性。结果 抗Aβ抗体总发生率为27.8％，各年龄组TAPIR阳性率差异无统计学意义；其免疫特性与中老年健康对照者相似。结论 抗Aβ抗体的出现可能早于脑实质Aβ和老年斑的形成。 【关键词】 抗β淀粉样蛋白抗体 青少年 Alzheimer病 Expression of naturally occurring plasma anti-β amyloid antibody in children and youngsters XU Wu-hua, QI Song-tao, GUEI Jian-jun,et al.Department of Neurosurjery, Nanfang Hospital Affiliated to Southern Medical University, Guangzhou 510515,China Abstract：Objective To explore the expression of naturally occurring plasma anti-β amyloid （Aβ） antibody in children and youngsters .Methods According to each 10 years, 28 healthy cases aged from 1～30 years old were diviedd to 3 groups.In the 3 groups,the plasma anti-Aβ antibody was detacted by immunostained with paraffin sections from Tg2576 mice brain to make a specific tissue amyloid plaque immunoreactivity （TAPIR） and immunoprecipitation analysis. Results The total occurrence rate of anti-Aβ antibody was 27.8%. There was no significant difference of TAPIR positive rate in each age group. They had the similar immunospecialties to middle-aged and elderly healthy controls. Conclusion Plasma anti-Aβ antibody can be occured before amyloid deposits and senile plaques in brain. Key words：anti-β amyloid antibody； children and youngsters； Alzheimer’s disease β淀粉样蛋白（Aβ）沉积是Alzheimer病（AD）发病机制中最为关键性过程［1,2］。近年的研究［3-7］表明：自身抗原Aβ在免疫系统发育过程可以避开阴性选择而保留在正常免疫应答之中。我们以前的研究［8］证实自身抗Aβ抗体可在AD患者和健康老年人血浆中检出,并且差异无统计学意义。本研究将探讨在儿童和青少年健康个体血浆中抗Aβ抗体的发生规律和免疫特性，及其对AD发病机制的启示。1 对象与方法 1.1 对象 28名身体和智力发育健康的儿童和青少年，男12人，女16人；年龄1～30岁，平均 （12.4±2.6）岁。以10岁为1个年龄段分成3组。 1.2 方法 1.2.1 血浆制备 所有研究对象在获得其本人或家属签署知情同意书后抽取10 ml全血，立即制备成血浆储存于-70℃的冰箱备用。 1.2.2 组织淀粉样斑块免疫活性（TAPIR）分析 将16～18个月龄的Tg2576小鼠脑组织行5 μm连续切片，常规脱蜡水化后，在99%的蚁酸溶液浸泡３ min。正常山羊血清阻断非特异性结合，在200 μl的1∶100的血浆中4℃下过夜。随后操作步骤按照Vectastain Elite ABC试剂盒说明书的要求进行。分别设置多克隆抗Aβ抗体Ab9204 （1∶1000）和不加血浆作为TAPIR阳性和阴性对照。 1.2.3 TAPIR结果评判标准和分级 参照Ab9204染色结果，根据每张切片中阳性老年斑核心（SPC）的数目和染色深浅分为TAPIR（+）（≥5个SPC且被清晰染色）和TAPIR（-）（<5个SPC且被弱染）。在评判过程中阳性弥散斑、淀粉样血管病变均被排除在上述标准以外。 1.2.4 免疫印迹 蚁酸可溶性Aβ（FAβ）纯化、制备参照我们以前的方法［8］进行。20 μl蛋白G琼脂糖预洗后分别加入60 ng 人工合成Aβ40（sAβ40）、sAβ42 （美国Sigma公司）和30 ng FAβ，室温下孵育30 min，其上清液与20 μl蛋白G和10 μl血浆混合并在室温下摇荡3 h。离心后的沉降物经反复清洗，加样于凝胶孔中。经电泳、转印迹和阻断非特异性结合后，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜在 4℃下与单克隆抗Aβ抗体（6E10）溶液摇荡过夜后，与辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG溶液室温孵育2 h，最后在ECL溶液显色。 1.2.5 统计学方法 数据由SPSS 12.0统计软件处理，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。2 结 果 2.1 TAPIR结果 见表1及图1。TAPIR（+）见于各个年龄段组，阳性率为27.8 %。TAPIR（+）血浆能清晰地识别5个以上Tg2576小鼠大脑组织切片中的SPC。TAPIR（+）者中年龄最小为2岁，Fisher精确检验显示3组间TAPIR阳性率差异无统计学意义（χ2=10.25,P=0.23）。表1 各年龄段组TAPIR结果的比较（略） 2.2 免疫印迹结果 见图2。本组TAPIR（+）血浆在免疫沉积过程中显示与sAβ40和FAβ的亲和力较强，而与sAβ42的亲和力相对较弱。3 讨 论 上个世纪末人类进行的第一次Aβ42疫苗（AN1972）临床试验，尽管未出现转基因动物模型那样显著减少老年斑的临床效果，而且由于5%AD患者出现一过性非特异性脑脊髓膜炎而被迫终止［9］。随后的病理学分析支持了试验设计者最初设想——免疫后产生的抗Aβ抗体可以通过减轻Aβ沉积和老年斑形成而减慢AD患者认知功能衰退。在所有接受疫苗注射的患者血浆中，约 25%抗Aβ42抗体水平明显升高，而在出现不良反应的18例患者中，有15例（83%）产生了抗Aβ42抗体［10］。近年来的研究［3-7］进一步证实：Aβ作为一种自身抗原，在免疫系统发育过程中能够避开阴性选择，而被保留在正常免疫应答之中。抗Aβ抗体可自然地发生于健康人群和AD患者，但均未证实具有与主动免疫治疗相似的临床效果，并对血浆Aβ变量缺乏有效的调节［3-9］，部分研究者甚至质疑抗Aβ抗体的正面作用［6］。因此，抗Aβ抗体的临床意义和可能的作用机制仍有争议。采用TAPIR和免疫印迹分析方法，本研究延伸性地证实了既往研究结果：自身抗Aβ抗体不仅存在于中老年人，甚至早在儿童和青少年期即可产生。因此，本研究支持这样的假设——免疫系统对Aβ的应答从出生到死亡、从正常生理状态到AD病理状态始终保留在常规的“程序”中。本研究中3个年龄组间TAPIR阳性率差异无统计学意义，与既往以中老年人为研究对象的研究结果相吻合［8］。免疫印迹分析还发现，本组儿童和青少年抗Aβ抗体的免疫特性与健康成年人和AD患者之间也没有与年龄相关的差异。可以认为，自身抗Aβ抗体在AD发病机制中可能未必是重要或关键的促进Aβ清除因素。本研究为首次报告抗Aβ抗体可以自然存在于儿童外周血浆。以前的研究结果表明，血浆Aβ40、Aβ42水平以及Aβ40/Aβ42比值在自然衰老过程中也呈现出与年龄相关的变化规律［12］，但迄今为止尚没有研究证实外周血Aβ变量与自身抗Aβ抗体之间存在有意义的关联［5,8,10］。由于血浆Aβ含量和自身抗Aβ抗体均出现于儿童和青少年，而公认的AD患者脑内Aβ沉积始于中年或老年前期，因此推测：无论是血浆Aβ含量［13］还是自身抗Aβ抗体均与脑内Aβ负荷无关，而更可能是机体对Aβ这一特殊的自体抗原产生的免疫反应。【参考文献】 ［1］Hardy J, Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics［J］.Science,2002,297:353. ［2］薛寿儒，杨小旺.血小板β-淀粉样肽前体蛋白免疫强度及异构体比率对Alzheimer病的诊断价值［Ｊ］.临床神经病学杂志,2007,20:176. ［3］Du Y, Dodel R, Hampel H, et al. Reduced levels of amyloid beta-peptide antibody in Alzheimer’s disease［J］. Neurology,2001,57:801. ［4］Weksler ME, Relkin N, Turkenich R, et al. Patients with Alzheimer ’s disease have lower levels of serum anti-amyloid peptide antibodies than healthy elderly individuals［J］. Exp Gerontol,2002,37:943. ［5］Hyman BT, Smith C, Buldyrev I, et al. Autoantibodies to amyloid-beta and Alzheimer's disease［J］. Ann Neurol,2001,49:808. ［6］Nath A, Hall E, Tuzova M, et al. Autoantibodies to amyloid beta-peptide （Abeta） are increased in Alzheimer’s disease patients and Abeta antibodies can enhance Abeta neurotoxicity: implications for disease pathogenesis and vaccine development［J］. Neuromolecular Med,2003,3:29. ［7］Monsonego A, Zota V, Karni A, et al. Increased T cell reactivity to amyloid beta protein in older humans and patients with Alzheimer disease［J］.J Clin Invest,2003,112:415. ［8］徐武华,東海林幹夫,松原悦朗.阿尔茨海默病患者自身抗Aβ抗体的免疫特性和临床价值［J］.中华老年医学杂志,2006, 25:89. ［9］Orgogozo JM, Gilman S, Dartigues JF, et al. Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abeta42 immunization［J］.Neurology,2003,61:46. ［10］Hock C, Konietzko U, Streffer JR, et al. Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer’s disease［J］. Neuron,2003,38:547. ［11］Dodart JC, Bales KR, Ganon KS, et al. Immunization reverses memory deficits without reducing brain Abeta burden in Alzheimer’s disease model［J］. Nat Neurosci,2002,5:452. ［12］徐武华, 東海林幹夫, 松原悦朗, 等. 年龄相关的血浆Aβ水平变化及其对阿尔茨海默病的诊断意义［J］.中华神经医学杂志,2005, 4:766. ［13］DeMattos RB, Bales KR, Cummins DJ, et al. Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mouse model of Alzheimer’s disease［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:8850.
