伴皮质下梗死及白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病的NOTCH3基因诊断

伴皮质下梗死及白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病的NOTCH3基因诊断作者：唐晓梅    作者单位：100053北京，首都医科大学宣武医院老年病研究所    【摘要】  目的 分析伴皮质下梗死及白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）的NOTCH3基因突变类型。方法 对临床诊断为CADASIL的4例先证者、来自3个家系10例患者及4例无类似临床表现成员、以及100名健康对照者进行NOTCH3基因PCR扩增及变性高压液相色谱分析（DHPLC）检测；对DHPLC阳性结果进行DNA双向测序，明确致病性突变或多态类型。结果 在CADASIL先证者及其家系患者中共发现134半胱氨酸→酪氨酸（Cys134Tyr）、141精氨酸→半胱氨酸（Arg141Cys）、90精氨酸→半胱氨酸（Arg90Cys）3种突变类型，存在于第3、第4外显子，为杂合错义突变。同时发现15种多态类型。其中家系1和家系2中分别发现1名成员与先证者存在相同位点的NOTCH3基因致病性突变，尚未出现与先证者相应的临床表现，被确定为临床前期患者。结论 NOTCH3单基因突变是CADASIL的分子遗传学基础，第3、4外显子可能是中国CADASIL家系的热点突变区。第4外显子Cys134Tyr突变类型为国内首次报告。    【关键词】  伴皮质下梗死及白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病；NOTCH3基因；突变    NOTCH3 gene diagnosis in cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy 　　TANG Xiao-mei, YANG Jing-fang, FENG Xiu-li, et al. Institute of Geriatric,  Xuanwu Hospital, Capital Medical University,Beijing 100053,China    Abstract：Objective  To analyse  the mutation types of the NOTCH3 gene  with cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy（CADASIL）. Methods  Including 4 probands of CADASIL,10 cases of CADASIL and 4 normal members from 3  CADASIL families and 100 healthy controls were recruited. Genomic DNA was extracted from white blood cell. The amplicons were analyzed by the denaturing high-performance liquid chromatography （DHPLC） technique. The positive samples which identified by the DHPLC were  sequenced to determine the specific mutation or polymorphism, respectively. Results  Three heterozygous missense mutations including Cys90Arg, Arg141Cys, Cys134Tyr located in the exon3 and exon4 were found in  the 4 probands and 10 cases of CADASIL among the 3 families. 15 polymorphisms were also found.  2 members individual from family 1 and 2 were found to carry the same pathological mutations as in their proband but without clinical symptoms. They were identified as preclinical patients. Conclusions  Mutation detection of NOTCH3 is the molecular genetic mechanical for CADASIL. The exon3 and exon4 are possible hot mutation spots in Chinese patients. The mutation of Cys134Tyr in exon4 is a novel mutation which has not been reported previously in China.    Key words：cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy；NOTCH3 gene；mutation    伴皮质下梗死及白质脑病常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）在中、青年脑梗死发病中的遗传因素受到重视。目前，全世界已经有超过400个相关CADASIL家系报道，大多数为白种人。国内2000年报道了首例家系。本研究通过对4例中国CADASIL先证者及其家系进行NOTCH3基因研究，旨在了解相关热点基因突变区、突变类型，对临床前期患者做出基因诊断，以便了解中国CADASIL患者的自然病程。1  对象与方法　　1.1  对象　　1.1.1  CADASIL先证者 　　系2002～2003年首都医科大学宣武医院神经内科、温州医学院附属医院、山西医科大学附属医院就诊患者，男3例，女1例；年龄38～62岁，平均（45±6.8）岁。临床表现均为反复缺血性卒中发作及血管性痴呆（VD）。有明确家族史，无先兆性偏头痛发作，无高血压、糖尿病、高脂血症、血管淀粉样变性病史;否认吸烟、饮酒史。　　1.1.2  CADASIL家系成员组 　　共14人，男9人，女5人；年龄29～48岁，平均（34±6.8）岁。6人来自家系1，与先证者有血缘关系5人，其中3人（Ⅲ1、Ⅲ7、Ⅲ13）有缺血性卒中发作史，但无VD，2人（Ⅲ2、Ⅲ3）无临床症状;1人无血缘关系（Ⅱ1）。7人来自家系2，6人与先证者有血缘关系，其中5人（Ⅱ2、Ⅱ6、Ⅱ10、Ⅲ2、Ⅲ8）有与先证者相似的临床表现，1人（Ⅲ7）无临床症状；1人无血缘关系（Ⅱ14）。1人来自家系3，与先证者有血缘关系（Ⅱ7），但无先证者相似的临床表现。家系1～3谱图见图1。家系4未提供家系资料。　　1.1.3  正常对照组 　　系同期在首都医科大学宣武医院参加流行病学调查研究的健康查体者100名，男52名，女48名；年龄56～72岁，平均（63±8.2）岁。无神经系统变性病史及精神病史，无脑血管病高危险因素及家族史。　　1.2  方法　　1.2.1  DNA提取 　　入组者知情同意后，取肘静脉血10 ml（枸橼酸钠抗凝），4℃保存，两周内采用《分子克隆》第二版介绍的方法从血液白细胞中提取DNA。　　1.2.2  NOTCH3突变检测 　　（1）采用聚合酶链反应（PCR）体系：总反应体积为25 μl［去离子水18.7 μl， Mg2+缓冲液（15 mmol/L）2.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，引物F 0.5 μl，引物R 0.5 μl，模板DNA 0.5 μl及Taq酶 0.3 μl；引物序列见表1，其中第3、4、18、20外显子引物序列引用相关文献［6］，余引物序列均为使用oligo及DNAstar软件自行设计。（2）PCR扩增的热循环条件如下：95℃预变性5 min；95℃，30 s, ［第2外显子（60 ℃，45 s）；第3外显子（57℃，45 s）；第4外显子（58℃，45 s）；第5～ 22外显子（60 ℃，45 s）；第23外显子（59℃，45 s）］，72℃，70 s，35个循环； 72℃延伸10 min。（3）取5 μl PCR产物加入0.5 μl上样缓冲液，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压为120 V，30 min后观察结果，出现相应长度的单一PCR扩增条带，认为扩增成功，待变性高压液相色谱分析（DHPLC）检测。（4）DHPLC检测条件：2～3 μl的PCR产物被流动相为0.9 ml/min的速度带至DNA分离柱而得以分离，分析一个样品需要8～10 min。对经DHPLC检测为单峰的PCR产物调整柱温，调整范围在1～3℃，以观察峰形变化。分别选取CADASIL组及正常对照组突变峰型及正常单峰进行二次PCR扩增，送至上海生工生物工程技术服务有限公司，使用美国ABI公司377机型进行双向测序，确定致病性突变、多态及野生型基因序列。表1  外显子引物序列及产物片段大小（略）2  结  果　　2.1  NOTCH3基因致病性突变及多态类型 　　见表2及图2～4。4例先证者及其家系中共发现3种致病性突变，分别位于外显子3及4中。家系2中所有发病者及1名未发病者出现与先证者相同的基因突变。家系1中所有发病者及1名未发病者出现与先证者相同的基因突变。表2  先证者及其家系成员NOTCH3基因致病性突变类型（略）　　2.2  CADASIL先证者及其家系成员中NOTCH3基因多态性类型  见表3。4例先证者及其家系中共发现NOTCH3基因15种多态类型。表3  先证者及家系成员NOTCH3基因多态类型（略）3  讨  论    1977年Sourander等［1］首先报道了1个CADASIL家族，称之为遗传性多梗死性痴呆；1993年Tournier-Lasserve 等［2］将致病基因定位于19号常染色体；1996年进一步定位为NOTCH3基因［3］。NOTCH3基因编码含有2321个氨基酸的跨膜受体蛋白，其细胞外区包含34个表皮样生长因子重复序列（EGF-like），每个EGF-like包含6个高度保守的半胱氨酸残基，并形成3个二硫键。正常组织中，NOTCH3基因的表达严格限于血管平滑肌细胞。NOTCH3基因致病性突变导致EGF序列半胱氨酸残基数量的奇数化，破坏了规范的二硫键的配对，导致血管平滑肌细胞功能异常而致病［4，5］。CADASIL是系统性动脉疾病，但首先表现为脑部症状，其病理生理基础主要依赖于一些特殊的脑血管构筑特征和循环模式。血管平滑肌细胞在维持脑部穿通动脉灌注区域的灌注压和脑血流自身调节中起着重要作用［6］，故患者头颅影像学改变多为穿通动脉供血区的腔隙性梗死。本研究中家系1～3先证者头颅磁共振检查显示多发皮质下梗死，家系2先证者同时伴有脑桥梗死，均为长穿通动脉供血区。    CADASIL作为卒中、痴呆、偏头痛、癫疒间的病因，其诊断标准为：（1）中年起病，有反复脑缺血发作史，多伴有认知功能障碍及偏头痛发作史；（2）具有家族遗传性；（3）头颅影像学检查显示多灶性皮质下梗死及白质脑病；（4）电镜下发现小动脉中层平滑肌细胞表面存在嗜锇颗粒物质（GOM）沉积［7，8］；（5）NOTCH3基因检测可发现致病性突变。其中病理改变和基因检测为诊断的金指标，其余均缺乏特异性。临床常见的线粒体脑肌病、家族性白质脑病、Bingswanger病仅从临床表现及影像学改变，很难与CADASIL进行鉴别。此外，2000年Joutel 等［9］报道首例散发的CADASIL患者，并经测序证实患者NOTCH3基因的第4外显子存在致病性错义突变。对于散发的多发性梗死痴呆患者，即使没有明确的家族史也应考虑本病的可能性，由此可见家族遗传史也不是诊断CADASIL的必备条件。病理活检为有创伤性检查，患者接受程度差，且相关转基因小鼠实验［10］表明，特异性小动脉中层平滑肌细胞表面GOM沉积仅在疾病晚期才出现，对临床早期及临床前期患者诊断意义较低。故与CADASIL表现相似的疾病鉴别时，NOTCH3基因突变检测成为主要鉴别点，是目前从分子水平上诊断CADASIL的重要指标 ［11，12］。    本研究共检测出3种突变类型（90Arg→Cys，134Cys→Tyr，141Arg→Cys）,与国外同类研究结果一致［6］,分别造成膜外区第2、3 EGF-like区Cys数量的奇数化，均为杂合错义突变，其中一种为高度保守的Cys被Tyr替换，另外一种为Cys替代Arg。Cys134Tyr突变类型目前国内尚无报道。上述3种突变类型均未在正常对照组中发现。所发现的NOTCH3基因致病性突变均存在于第3、第4外显子，国内王朝霞等［13］进行相关CADASIL家系基因突变研究，共发现4种NOTCH3基因的突变类型，其中3种存在于第3外显子，1种存在于第11外显子。结合本研究结果，提示第3、第4外显子亦可能是中国CADASIL患者的热点突变区。建议在对中国CADASIL患者进行基因检测时，首先检测上述两个突变位点，如未发现致病性突变，再进行其他的外显子检测［14，15］。    本研究同时发现多个多态类型，突变发生在内含子区及外显子区，但均未造成Cys残基数量的改变，多为同义突变，故无临床意义。    CADASIL的自然病程多为30岁出现伴有先兆的偏头痛，10年后出现首次卒中发作，20～30年后出现皮质下痴呆，病程多为20～30年 ［16，17］。CADASIL的整个病程是千变万化的，即使在同一个家系，病程的表现差异也很大，所以对家庭成员进行早期基因检测，可及时发现临床前期的患者。本研究对CADASIL家系1及家系2先证者的一级亲属进行相同位点基因检测，发现了2例临床前期患者（见家系谱图所示家系1Ⅲ3及家系2Ⅲ7），具有与先证者相同基因位点突变，但无相应的临床症状及神经系统体征，智能评定均正常（家系2Ⅲ7头颅磁共振检查显示多发皮质下梗死；家系1Ⅲ3头颅影像学检查未见异常）。临床前期患者的发现有助于对中国CADASIL患者的自然病程的了解和早期干预实施。    对中国CADASIL患者分子水平的诊断研究例数有限，部分结论应扩大研究对象进一步证实。目前对该病尚无有效的治疗方法，早期改善循环是否能延缓疾病进展值得进一步探索。【参考文献】　［1］Sourander P, Walinder J. Hereditary multinfarct dementia. Morphological and clinical studies of a new disease［J］. Acta Neuropatho,1977,39:247.　［2］Tournier-Lasserve E, Joutel A, Melki J, et al. Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy maps to chromosome 19p12［J］. Nat Genet, 1993,3:256.　［3］Joutel A, Corpechot C,Ducros A, et al. NOTCH3 mutations in CADASIL, a hereditary adult-onset condition causing stroke and dementia［J］. Nature,1996,383:707.　［4］Fryxell KJ, Soderlund M, Jordan TV,et al. An animal model of the molecular genetics of CADASIL［J］. Stroke, 2001,32:6.　［5］Dichans M, Ludwig H, Muller J, et al. Small in-frame deletions and missense mutations in CADASIL: 3D models predict misfolding of NOTCH3 EGF-like repeat domains［J］. Euro J Hum Genet, 2000,8:280.　［6］Joutel A, Vahedi K, Corpechot C, et al. Strong clustering and stereotyped nature of Noth3 mutations in CADASIL patients［J］. Lancet, 1997,350:1511.　［7］Mayer M, Straube A, Bruening R, et al.Muscle and skin biopsies are a sensitive diagnostic tool in the diagnosis of CADASIL［J］. J Neurol, 1999,246:526.　［8］Kanitakis J, Thobois S, Claudy A, et al. CADASIL（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy）: a neurovascular disease diagnosed by ultrastructural examination of the skin［J］. J Cutan Pathol,2002, 29:498.　［9］Joutel A, Dodick DD, Parisi JE, et al. De novo mutation in the NOTCH3 gene causing CADASIL［J］. Ann Neurol,2000,47:388.　［10］Marie MR, Valerie D, Peggy B, et al. Transgenic mice expressing mutant NOTCH3 develop vascular alterations characteristic of cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy［J］. Am J Pathol, 2003,162:329.　［11］Malandrini A, Albani F, Palmeri S, et al. Asymptomatic cores and paracrystalline mitochondrial inclusions in CADASIL［J］. Neurology, 2002,59:617.　［12］Joutel A, Tournier-Lasserve E. Molecular basis and physiopathogenic mechanisms of CADASIL: a model of small vessel diseases of the brain［J］. J Soc Biol,2002,196:109.　［13］王朝霞，吕鹤，张英，等.伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病四个家系的NOTCH3基因突变研究［J］.中华医学杂志,2004,84:1175.　［14］Markus HS, Martin RJ, Simpson MA, et al. Diagnostic strategies in CADASIL［J］. Neurology,2002,59:1134.　［15］Dong Y, Hassan A, Zhang Z, et al. Yield of screening for CADASIL mutations in lacunar stroke and leukoaraiosis［J］. Stroke,2003,34:203.　［16］Abe K, Murakami T, Matsubara E, et al. Clinical features of CADASIL［J］. Ann N Y Acad Sci,2002,977:266.　［17］Kalimo H, Ruchoux MM, Viitanen M, et al. CADASIL: a common form of hereditary arteriopathy causing brain infarcts and dementia［J］. Brain Pathol,2002,12:371.