脑缺血性损伤中细胞凋亡的研究进展

脑缺血性损伤中细胞凋亡的研究进展作者：杨彦玲    作者单位：716000延安大学医学院生理教研室    【关键词】  脑缺血性损伤 细胞凋亡    神经元凋亡是缺血性脑损伤过程中神经元死亡的重要形式。凋亡的发生既与凋亡相关基因表达有关，又受许多因素调节。现将脑缺血神经元凋亡调节的多种因素和抗凋亡治疗研究的进展综述如下。1  脑缺血神经元凋亡的调节　　1.1  兴奋性氨基酸与自由基 　　研究表明，谷氨酸受体如N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA） 受体、红藻氨酸（ KA） 受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异戊丙酸（AMPA） 受体和亲代谢受体等的过度激活均可诱导细胞凋亡。同时，自由基在神经元的凋亡中也起重要作用。Fujimura等［1］对高度表达铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）转基因大鼠和野生型大鼠用线栓法阻断大脑中动脉制备脑缺血模型，24 h后，在转基因大鼠凝胶电泳可观察到“DNA梯”图谱，说明氧自由基是诱导神经细胞凋亡的重要因素之一。脑缺血时,神经元能表达环氧合酶-2 （Cox-2） 和诱导型一氧化氮（iNOS）,激活小胶质细胞产生活性氧（ROS）。ROS 攻击线粒体使细胞色素C（Cyt-C） 从线粒体释放到胞浆中,Cyt-C 能激活Caspase 基因,诱导细胞凋亡；ROS也可通过上调核转录因子（NF）-κβ使Cox-2、iNOS等表达增高［2］。有研究［3］表明,缺氧应激对缺血再灌注的脑组织内皮细胞有基因毒性和细胞毒性的作用,表现为染色体畸变、细胞凋亡等。　　1.2  细胞内钙超载 　　细胞内钙超载在缺血性神经元凋亡中起关键作用。缺血性脑损伤激活NMDA和AMPA受体，导致Ca2+内流，膜电位的去极化使电压依赖性Ca2+通道开放以及钠钙离子的交换使Ca2+的内流进一步加速。钙超载及其所触发的一系列有害代谢是导致神经细胞死亡的“最后共同通路” ［4］。在胎鼠皮质神经元培养液中加入Ca2+载体，使细胞内Ca2+的浓度升高，可诱导神经元的凋亡。当细胞内Ca2+浓度升高时，激活核酸内切酶，使核染色质DNA降解成寡核苷酸小体，从而在琼脂糖凝胶电泳时呈现为特征性DNA图谱。另外，Ca2+还能活化Ⅱ型转谷氨酰胺酶，此酶参与了凋亡小体的形成。最新研究［5］发现，血清Ca2+浓度可被用作预测缺氧缺血性新生儿脑病的转归。　　1.3  Caspase家族 　　Caspase家族属于半胱氨酸基天冬氨酸基-特异性蛋白酶，参与细胞凋亡的信号转导。根据其在级联反应中的作用位置分为两类：（1）激活或调节其他Caspase，包括Caspase-1、2、4、5、8、9、10；（2）介导细胞凋亡下游的执行阶段，包括Caspase-3、6、7、14。Caspase-3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种死亡受体介导凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。脑缺血后，神经元Caspase-3 mRNA及蛋白表达增加、酶活性增强，活化时的裂解产物Caspase-3 p20免疫反应阳性，均定位于TUNEL阳性的神经元内。而且Caspase的活化与神经元凋亡呈时间依赖性关系。Caspase-3抑制剂可显著抑制缺血易损区Caspase-3的活性，阻止聚ADP核糖多聚酶裂解,从而抑制神经元凋亡、改善神经功能［6］。　　1.4  CytC 　　CytC自线粒体释放入胞浆是诱导细胞凋亡的关键环节。一旦CytC释放，就将通过细胞凋亡蛋白酶活化因子-1介导的Caspase蛋白酶活化的快速凋亡机制使细胞死亡。Zhivotovskyd等［7］将20 μmol/L CytC分别注入不同类型细胞中发现，CytC可诱导细胞凋亡。在大鼠短暂性局灶性脑缺血后4 h内，缺血侧神经元胞浆内出现CytC。Western Blot分析显示，胞浆片段出现明显的相对分子质量15×103条带，具有CytC特性，且仅出现于缺血半球神经元胞浆中；缺血90 min后，纹状体和皮质区神经元可见染色体凝聚、核碎裂和凋亡小体出现。表明短暂性局灶性脑缺血后CytC自线粒体释放入胞浆在缺血后神经元凋亡中起重要作用。　　1.5  即早基因（IEGs） 　　IEGs是脑缺血后快速而短暂表达的一组基因的统称，目前研究较多的有c-fos和c-jun家族。Hata等［8］研究表明，大鼠大脑中动脉阻断（MACO）1 h后，c-fos和c-jun mRNA表达开始升高，主要位于半暗带区和梗死周边的正常组织；短暂缺血再灌注3 h后即发现c-fos、c-jun蛋白在脑组织海马等结构有强阳性表达，缺血时间越短，两基因表达的高峰时间越快，因而在一定程度上反映了缺血性脑损害的严重程度［9］。目前认为，IEGs是一种核内第三信使。缺血诱导IEGs表达后fos和jun蛋白产物通过亮氨酸拉链形成同源或异源二聚体复合物-转录因子AP-1结合到靶基因的AP-1位点，使AP-1活性增加，诱导其他基因表达增加并参与对神经元凋亡的调控。　　1.6  Bcl-2家族  　　Bcl-2家族蛋白是凋亡的重要调控因子，具有相互对立的两大类蛋白:（1）抗凋亡作用的Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xl等；（2）促凋亡作用的Bax、Bak、Bcl-xs。过度表达Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xl可阻止CytC从线粒体的释放和Caspase的激活，从而抑制细胞凋亡；而Bax、Bak、Bcl-xs可直接诱导CytC从线粒体释放入胞浆。有研究［10，11］表明，Bcl-2/Bax的相对量决定了线粒体PT通道的开放；Bcl-2/Bax比值降低，线粒体PT通道开放，线粒体内的CytC释放到胞质中，从而引起细胞凋亡。Choi等［12］研究MCAO大鼠模型时发现应用西洛他唑（Cilostazol）清除羟氧基和氧自由基，可以减少缺血半暗带的Bax蛋白表达水平，相应的提高Bcl-2蛋白表达和抑制CytC的释放，减少缺血脑组织梗死体积，抑制细胞凋亡。　　1.7  P53基因 　　P53在细胞DNA损伤和诱导凋亡中发挥重要作用。DNA遭受外来损伤，P53可作为转录因子诱导一系列下游基因的表达，如P21、Gadd45、PCNA或直接与DNA单、双链结合等多种机制，介导细胞停止在G1期，参与DNA修复反应。Maeda等［13］研究短暂性脑缺血后P53的表达，发现缺血区突变型P53蛋白阳性反应出现于再灌注6～96 h，与脑缺血的严重程度正相关，表达于神经元、胶质细胞和细胞间隙。　　1.8  热休克蛋白（Hsp） 　　Hsp70对细胞损伤有保护作用［１4］，正常脑组织Hsp70 mRNA及其蛋白含量极少，短暂性脑缺血后，受损细胞内大量产生的变性蛋白可诱导Hsp70基因的表达。轻度脑缺血可诱导Hsp70在神经元中的转录和翻译；中度脑缺血可诱导Hsp70转录，但翻译受阻；重度脑缺血，梗死区神经元无Hsp70表达，但内皮细胞可表达Hsp70 mRNA及蛋白，提示Hsp70可作为细胞或组织遭受可逆性缺血损害的标志。Hsp60和Hsp10是线粒体基质蛋白，由应激诱导产生并且形成伴侣蛋白复合物，这种复合物与蛋白质在线粒体中的折叠与装配有关，而凋亡与线粒体功能障碍有密切关系。　　1.9  一氧化氮（NO）　　NO在脑缺血的病理生理机制中有双重作用,即参与脑缺血急性损伤与迟发神经元死亡过程,并具有一定的神经保护作用。NO 诱导神经细胞凋亡的机制有: NO直接损伤DNA，或氧化生成过氧化亚硝酸盐，引起细胞凋亡；抑制DNA 修复酶的作用,激活聚腺苷二磷酸核糖合成酶,使细胞能量衰竭。NO 可影响基因的表达,在星形胶质细胞中可下调Bcl-2 和上调Bax ,激活Caspase-3，启动凋亡程序［15］。　　1.10  Fas/ Fasl 　　Fas又称作APO-1／CD95，是人们在研究膜蛋白抗体的溶细胞作用时被发现的进而从细胞毒性T细胞中分离了Fas的配体（Fasl），建立了Fas／Fasl细胞凋亡信号传导系统。Fas含死亡结构域（DDs），与Fas发生反应的蛋白是Fas死亡结构域相关蛋白（FADD）。Fas与FADD通过DDs形成二聚体而相互作用。FADD N末端称为死亡效应结构域，负责将凋亡信号传递至Caspase-8，使之活化，从而启动Caspase级联反应,细胞产生凋亡。Fas／Fasl介导的是促细胞凋亡信号通路。脑缺血损伤后，在海马CA1区神经元、胶质细胞、室管膜细胞表面有Fas mRNA的高表达，并与凋亡细胞分布一致［16］。　　Rosenbaum等［17］对野生型和Fas基因突变鼠前脑缺血后神经元凋亡情况的研究发现，两组鼠在缺血24 h后均有神经元凋亡，但Fas基因突变型鼠脑梗死面积明显减小。以上结果提示：若采用一些干预因素下调Fas、Fasl的表达可能抑制缺血神经元凋亡的数量。　　1.11  Par-4  Par-4又称前列腺凋亡反应素-4，前脑缺血的大鼠，其海马和纹状体神经元中Par-4水平升高，以及再灌注6 h内升高，并在此后神经元凋亡的3 d内持续升高。在短暂局灶性缺血的小鼠脑中，再灌注6～12 h期间，梗死边缘的皮质和纹状体中Par-4升高。一个由Par-4反义寡核苷酸保护的培养基能抵御由化学因素或缺氧引起的凋亡，并且显著减少小鼠的缺血损伤；早期Par-4上调在缺血性卒中模型和缺血神经元的死亡中起了关键性的作用［１8］。　　1.12  其他 　　当细胞受到肿瘤坏死因子α、谷氨酸盐酯、神经生长因子、ROS等NF-κB的激动剂刺激时，NF-κB 激活进入核内，诱导多种基因表达，包括促炎细胞因子、趋化因子、黏附分子等基因表达，同时促进抗凋亡基因表达；NF-κB 还可以调控细胞因子的释放，因为细胞因子白介素（ IL）-6、IL-8 等具有延迟细胞凋亡的作用。蛋白激酶C通道是细胞内一条重要的信息传递通路，可以磷酸化下游元件使NF-κB 释放而发挥作用；也可以激活丝裂原活化蛋白激酶促进细胞凋亡［19］。2  细胞凋亡与脑缺血的治疗    大量研究表明，一些凋亡抑制剂如ZYVAD-FMK （Z-Tyr-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone）  、ZDEVD -FMK （N-benzyloxycarbonyl-Asp-Glu-Val-Asp-fluoromethyl ketone）、ZVAD -FMK  Z-ValAla-Asp - fluoromethyl ketone）、P53、CrmA（Cytokine response modifier A）、凋亡抑制蛋白、Bcl-2家族均可抑制细胞凋亡 、缩小梗死体积、改善脑水肿、延长治疗时间窗。Caspase抑制剂与NMDA受体拮抗剂（MK-801）联合应用比单一应用效果更佳。神经生长因子的抗凋亡作用目前已被确认，可能通过抑制神经细胞骨架蛋白变性和/或促进其再生而发挥作用。胰岛素样生长因子在脑的发育和损伤过程中发挥重要作用，能够调节神经元生长、分化和修复，特别是通过阻止细胞凋亡来延长神经元寿命。亚低温抑制脑细胞凋亡，降低脑组织耗氧量，改善细胞能量代谢。亚低温可能通过影响凋亡过程中特定的生长信号、拮抗核酸内切酶活性、拮抗IGEs表达等机制抑制细胞凋亡。国内有学者发现电针治疗可以抑制脑缺血后的神经细胞凋亡［20］。    综上所述, 脑缺血后细胞凋亡是多因素介导的,随着对细胞凋亡研究的深入,将会使我们以新的角度去认识脑缺血再灌注损伤,为临床防治脑缺血再灌注损伤和预防神经细胞凋亡提供新的思路。【参考文献】　［1］Fujimura M,Morita-Fujimura Y,Narasimhan P,et al.Stroke,1999,30:2408.　［2］Chan PH. 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