当前位置:首页 > 文献频道 > 临床内科学 > 文献详细

《神经内科》

局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑内肾素血管紧张素系统的变化及厄贝沙坦干预的影响

发表时间:2009-10-13  浏览次数:665次

作者:石静萍,董靖德,张颖冬,林新建    作者单位:210029南京医科大学附属脑科医院神经内科

【关键词】  肾素血管紧张素系统;脑缺血;厄贝沙坦

    Changes of renninangiotensin system in rats with focal brain ischemiareperfusion injury and the effects of intervention  with Irbsartan  SHI Jingping, DONG Jingde, ZHANG Yingdong, et al. Department of Neurology, Brain Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Chain

    Abstract:Objective  To explore the changes of renninangiotensin system in rats with focal brain ischemiareperfusion injury and the effects of intervention and neuroprotective  mechanisms  with Irbsartan. Methods  The male SD rats were randomly assigned to sham operated group, ischemiareperfusion (IR) group and Irbsartan pretreatment group. The focal IR model was made by suture occlusion of right middle cerebral artery (MCAO). At 24 h and 72 h following onset of MCAO with reperfusion,the neurologic impairment function scores and the infarction volume were evaluated, the mRNA expression of angiotensinⅡ type 1  receptor (AT1R)  and  angiotensinⅡ type 2  receptor(AT2R)were detected by RTPCR, and AngⅡ levels and Renin activity were examined by radioimmunoassay. Results  (1) Pretreatment with Irbsartan could significantly improve neurological outcome and reduced infarction size. (2) In bilateral cerebral cortex, hypothalamus, brain stem and peripheral blood leucocyte, the mRNA expressions of the AT1R and AT2R were significantly increased after either 24 h or 72 h of MCAO with reperfusion (all P<0.01). AT1R  mRNA expression was downregulated while AT2R mRNA expression was upregulated by pretreatment with Irbsartan in the abovementioned areas(all P<0.01). (3)Compared with the sham group, the levels of angiotensinⅡin brain and peripheral blood as well as renin in peripheral blood in IR group were significantly elevated 24 h and 72 h after reperfusion, but there was no significantly different between Irbsartan group and IR groupt.Conclusions  The AngⅡ and expression of AT1R and AT2R may elevate in rats with focal brain ischemia. Pretreatment with Irbsartan may play protective role on ischemic brain injury, and blocking AT1R,downregulating AT1R mRNA expressions and upregulating AT2R mRNA expression may be involved in the mechanisms.

    Key words:renin angiotensin system;brain ischemia;Irbsartan

      近期的临床研究[1-4]表明,肾素血管紧张素系统(RAS)阻滞对预防脑卒中有重要作用,一些基础研究[3,4]结果也表明中枢RAS可能参与缺血性脑损伤的病理生理过程。然而在缺血性脑损伤中脑内RAS的变化及其作用至今仍未完全阐明。本研究旨在了解大鼠局灶性脑缺血状态下脑内RAS变化以及1型血管紧张素受体(AT1R)拮抗剂厄贝沙坦预处理对RAS和缺血性脑损伤的影响,探讨AT1R拮抗剂的脑保护作用及其可能的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  动物与分组  清洁级雄性SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,合格证号SCXK(沪)20030003,质量150~180 g。根据随机数字表将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注(IR)组、厄贝沙坦预处理组,每组20只,每个组又分为缺血24 h和72 h两个亚组(每组10只)。

    1.2  方法

    1.2.1  动物模型制作与处理  厄贝沙坦(赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司赠予)组大鼠给予厄贝沙坦30 mg/(kg·d)(6 mg/ml),每日上午灌胃1次,连续给药3周;假手术组和IR组均于相同时间予等量的生理盐水灌胃。给药前及给药1周、2周和3周用鼠尾计测血压。给药结束后,采用改良的 Longa方法[2],用3/0尼龙线栓塞大鼠右侧大脑中动脉(MCA), 缺血90 min后抽出尼龙线栓,建立局灶性脑IR模型;假手术组除不插线外,其余步骤相同。各组于缺血后24 h、72 h观察肢体瘫痪、转圈等神经系统症征,参照Longa 5级4分法作神经功能缺损程度评分; 1~3分为IR模型成功。

    1.2.2  标本制作  在相应观察时间点,每组取5只大鼠,10%水合氯醛麻醉后,快速断头取脑分离双侧大脑皮质、下丘脑和脑干,取上述各部位脑组织0.1 g和0.5 g分别加入含抑肽酶和乙酸的试管中,匀浆、4℃以下离心,取上清液-20℃保存用于脑组织肾素和AngⅡ测定;其余脑组织-80℃保存待mRNA抽提。同时取血2 ml置入含抑肽酶和EDTA的预冷抗凝管内,4℃以下离心,取血浆-20℃保存,用于外周血肾素和AngⅡ测定;另外4 ml血分离白细胞,后加入1 ml Trizol(Invitrogen公司) 混匀后放入-80℃保存,用于血RNA抽提。

    1.2.3  脑梗死体积测定  各组在相应观察时间点,分别取5只大鼠,快速断头取脑,-20℃冰箱冷冻10 min,从大脑半球额极至枕极连续冠状切片5片,每片厚2 mm。脑片用2%TTC染色,数码相机拍照,用Image J软件测出梗死面积,梗死体积=梗死面积之和×脑片的厚度。为消除大鼠个体差异,本研究采用梗死体积占半球体积比率(V%)表示,V%=梗死体积/缺血半球体积×100%。

    1.2.4  脑组织和外周血AT1R、AT2R mRNA表达的测定  (1)总RNA的提取:脑组织复温后,将脑组织按左右皮质、下丘脑、脑干4个部位各取0.1g,提取脑组织及血白细胞的总RNA,取一定量的总RNA在紫外分光光度计上测定其浓度,所提取的总RNA的A260/ A280比值均≥1.8。(2)mRNA测定: 采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR )方法,试剂盒购自Promega公司,从Genebank中检索大鼠脑AT1、AT2受体和GAPDH基因全长序列,按引物设计的基本原则设计引物。扩增产物进行2%琼脂糖电泳,采用凝胶成像扫描系统对RTPCR产物电泳条带的光密度值进行半定量分析。

    1.2.5  脑组织和外周血肾素、AngⅡ测定  用放射免疫法测定脑组织和外周血肾素、AngⅡ,试剂盒由北京北方生物技术研究所提供,操作方法按试剂盒说明书进行。

    1.2.6  统计学方法  检测结果用均数±标准差(±s)表示,采用SPSS 12.0软件对所测数据进行处理,两样本均数间比较采用t检验,多样本均数间比较采用方差分析。

    2  结  果

    2.1  厄贝沙坦组与IR组神经功能缺失评分比较  厄贝沙坦组缺血24 h和72 h神经功能缺失评分分别为(1.30±0.48)分和(1.40±0.52)分,与同时间点IR组[分别为(1.90±0.74)分和(2.00±0.67)分]比较差异有统计学意义(均P<0.01)。

    2.2  厄贝沙坦组与IR组脑梗死体积比较  IR 24 h和72 h厄贝沙坦组梗死体积较IR组分别减少41.9%和38.2%,均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

    2.3  3组脑组织和外周血AT1R mRNA、AT2R mRNA表达比较  见表1、2。与假手术组比较,缺血24 h、72 h厄贝沙坦组、IR组缺血侧和对侧皮质、下丘脑、脑干AT1R mRNA表达和AT2R mRNA表达均显著性增高(均P<0.01),外周血白细胞AT1R mRNA和AT2R mRNA表达也呈同步性变化。与IR组比较,厄贝沙坦组在IR 24 h和72 h上述部位AT1R mRNA表达显著低于IR组(P<0.01),而AT2R mRNA表达显著高于IR组(P<0.01)。

    2.4  3组脑组织和外周血AngⅡ和肾素水平比较  见表3。与假手术组比较,厄贝沙坦组和IR组IR 24 h和72 h脑组织、外周血AngⅡ水平均显著性增高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),外周血肾素水平也显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),而脑内肾素水平差异无统计学意义。厄贝沙坦组与IR组比较,脑组织和外周血AngⅡ和肾素水平差异亦无统计学意义。 表1  IR 24 h和72 h各组大鼠脑内不同部位和外周血AT1R mRNA的表达 注:与同时间点假手术组比较*P<0.01;与同时间点IR组比较△P<0.01;与同组内24 h比较▲P<0.05 表2  IR 24 h和72 h各组大鼠脑内不同部位和外周血AT2R mRNA的表达 注:与同时间点假手术组比较*P<0.01;与同时间点IR组比较△P<0.01;与同组内24 h比较▲P<0.05  表3  各组大鼠再灌注24 h和72 h脑和外周血AngⅡ和肾素水平比较  注:与同时间点假手术组比较△P<0.05,*P<0.01

    3  讨  论

    脑组织与脑外其他器官的组织一样,存在独立而完善的局部RAS,血管紧张素Ⅱ是RAS的主要活性介质,其作用主要是通过AT1R、AT2R两种受体介导而实现。从AngⅡ的受体分布来看,AT1R在成年鼠脑分布的密度很高,已检测到大鼠脑干、中脑、下丘脑和视前叶等均有AT1R的表达;相对于AT1R,成年鼠脑AT2R仅低水平表达,其分布主要在涉及学习、控制运动、感觉区大脑皮质[5],但在病理情况下如脑损伤、创伤愈合时AT2R上调[6]。生理状态下脑内AT1R介导的作用占优势,已知的AngⅡ大多数外周和中枢的生理作用如血管收缩、增加血压、增加水钠摄取、丘脑下部激素分泌等都是通过AT1R介导。本研究发现大鼠局灶性脑缺血后缺血侧皮质、对侧皮质、下丘脑、脑干的AT1R mRNA、AT2R mRNA表达和AngⅡ水平均显著增高,表明局灶性脑缺血后24 h即可诱导全脑的RAS的普遍激活,并且这种增高反应至少持续72 h。对于局灶性脑缺血后脑内RAS的变化, 不同作者研究的结论相同,即在缺血半暗带周围和对侧皮质AT2R表达上调和AngⅡ增高的结果[6,7],但对AT1R mRNA 的改变,已有的研究结果不一:Kagiyama等[6]对SD大鼠局灶性脑缺血模型研究表明,缺血24 h时AT1R表达在缺血侧显著性增高,对侧皮质无变化; 而Li等[8]对Wistar大鼠的局灶性脑缺血模型研究发现:在缺血24 h时AT1R表达在双侧皮质均无变化,这些结果的不同可能与大鼠的种类、缺血后观测时间点不同有关。本研究发现,尽管脑缺血后脑内AngⅡ水平增高,但调控AngⅡ产生的主要物质肾素活性无显著变化。Makino等[7]在短暂性全脑缺血模型中也发现AngⅡ产生的上游物质血管紧张素原 mRNA表达无明显变化,提示脑组织RAS生成途径可能不完全相同于循环系统RAS。此外,本研究还发现,局灶性脑缺血时外周血AngⅡ和肾素水平也显著性升高,表明不仅脑内RAS早期即参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程,循环RAS可能也介入了这一病理过程,这与我们以往的临床研究结果[9]一致。

    近期研究[10]认为AngⅡ通过AT1R介导不仅有强的血管收缩作用,还有促炎因子作用、促凋亡作用。AngⅡ经AT1R可激活前炎症因子NFkB的表达,启动炎症因子的转录,增加血管通透性,增强白细胞黏附和氧化应激反应,进而加重血管内皮细胞和脑组织缺血再灌注损伤。厄贝沙坦是一种非肽类AT1R阻滞剂,可通过血脑屏障,阻滞中枢的AT1R所介导的神经损伤[11]。本研究结果显示,厄贝沙坦预先治疗3周可显著地减少大鼠脑缺血后的脑梗死体积,改善神经功能缺失评分,对脑缺血大鼠的神经损伤有保护作用。由于厄贝沙坦有降血压作用,故厄贝沙坦通过降低血压而产生的神经保护作用不能完全排除。然而,Hosomi等[12]报道给SD大鼠低剂量和大剂量AT1R拮抗剂 (Olmesartan)后,低剂量组大鼠血压不改变,但两组均显示神经功能缺失评分改善、脑梗死体积和水肿范围减少。提示AT1R拮抗剂对缺血性损伤的保护作用可能独立于降压作用之外。本实验结果显示,厄贝沙坦预先处理可降低缺血大鼠脑各部位及外周血白细胞的AT1R表达,上调AT2R表达,但并未改变脑内AngⅡ水平,推测厄贝沙坦对缺血大鼠的神经保护作用不仅在于抑制AT1R介导的损伤作用,同时也与增强AT2R的作用有关。

    目前有关AT2R介导的神经保护作用所知甚少。AT2R基因敲除动物研究[13]发现,在局灶性MCA闭塞动物模型研究中,AT2R缺失大鼠与正常野生型大鼠比较,脑梗死体积明显扩大,梗死周围脑组织血流降低,脑缺血区超氧化物歧化酶和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性增强,且AT1R拮抗剂对AT2R缺失大鼠的保护作用较野生型大鼠减弱,提示AT2R的存在是AT1R拮抗剂脑保护作用的前提条件。生化和电生理证据提示经AT2R介导的作用在许多方面与AT1R相拮抗,AngⅡ作用于AT2R可诱导缓激肽释放,进而刺激内皮细胞合成与释放一氧化氮而发挥扩血管效应,通过增加侧支循环,减少梗死区周围脑血流的下降[14]。近期有报道[8]AngⅡ经AT2R介导有类神经生长因子样作用,可启动神经损伤后的神经细胞分化和轴索再生,提示在脑缺血时刺激AT2R可能的神经保护作用与对抗血管收缩、抑制氧化反应、抗细胞凋亡、促进神经再生有关。因此,急性脑缺血时AT2R上调可能是机体自身一种内源性的保护机制。

【参考文献】[1]Schiffrin EL. Progress in secondary prevention of stroke with PROGRESS. The perindopril protection against recurrent stroke study[J]. Curr Hypertens Rep,2002,4:39.

[2]Dahlof B, Devereux RB, Kjeldsen SE, et al. Cardiovascular morbidity and mortality in the Losartan intervention for endpoint reduction in hypetension study (LIFE): a randomised trial against atenolol[J]. Lancet,2002,359: 995.

[3]Walther T, Olah L, Harms C, et al. Ischemic injury in experimental stroke depends on angiotensin II[J]. FASEB J,2002,16:169.

[4]Saavedra JM. Brain Angiotensin II: New developments, unanswered questions and the rapeutic opportunities[J]. Cell Mol Neurobiol,2005,25:485.

[5]Lenkei Z, Palkovits M, Corvol P,et al. Expression of angiotensin type1 (AT1) and type2(AT2) receptor mRNAs in the adult rat brain: a functional neuroanatomical review[J]. Front Neuroendocrinol,1997,18:383.

[6]Kagiyama T, Kagiyama S, Phillips MI. Expression of angiotensin type 1 and 2 receptors in brain after transient middle cerebral artery occlusion in rats[J]. Regul Pept,2003,110:241.

[7]Makino I, Shibata K, Ohgami Y,et al. Transient upregulation of the AT2 receptor mRNA level after global ischemia in the rat brain[J].Neuropeptides, 1996,30:596.

[8]Li J, Culman J, Hortnagl H,et al. Angiotensin AT2 receptor protects against cerebral ischemiainduced neuronal injury [J].FASEB J,2005,19:617.

[9]石静萍,张颖冬,葛剑青,等. 急性脑梗死患者血浆肾素、血管紧张素Ⅱ的变化及其临床意义[J]. 临床神经病学杂志.,2002,15:204.

[10]Suzuki Y, RuizOrtega M, Lorenzo O,et al.Inflammation and angiotensin Ⅱ[J].Int J Biochem Cell Biol,2003,35:881.

[11]Hosomi N,Nishiyama A,Ban CR, et al. Angiotensin type1 receptor blockage improves ischemic injury following transient focal cerebral ischemia[J]. Neuroscience,2005,134:225.

[12]Masaru I,Hong WL,Rui C,et al.Possible inhibition of focal cerebral ischemia by angiotensin II type 2 receptor stimulation[J].Circulation,2004,110:843.

[13]Chen Y, Doodsoo K, Toru A, et al.Functional interplay between angiotensin II and nitricoxide :cyclic GMP as a key mediator [J].Arterior Thromb Vascular Biol,2003,23:26.

[14]戴文卓,石静萍,葛剑青,等.厄贝沙坦对急性脑梗死患者血浆溶血磷脂酸、内皮素1和血清一氧化氮含量的影响[J].临床神经病学杂志,2007,20:81.

医思倍微信
医思倍移动端
医思倍小程序