影响神经干细胞定向分化因素的研究进展

作者：方鑫，王芙蓉，姜亚平    作者单位：430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科

【关键词】  神经干细胞;定向分

      神经干细胞（NSC）具有自我更新和多分化潜能属性，可分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，这使得NSC移植替代神经系统疾病中丢失的细胞成为可能。NSC在胚胎和成体中枢神经系统均存在。NSC移植在体内环境下（尤其是非神经发生区域）绝大多数分化成胶质细胞（星形胶质细胞），有可能会加重胶质瘢痕形成。在中枢神经系统疾病的NSC细胞替代治疗策略中，NSC分化成合适的细胞类型显得格外重要。现就影响NSC定向分化的因素作一综述。

    1  影响NSC向神经元分化的因素

    1.1  Nurr1  Nurr1是一种细胞核受体，其对中脑多巴胺能神经元发育是必需的。Sousa等［1］研究发现原代培养的表达Nurr1的NSC，提高了中脑多巴胺能神经元存活，而且使其更能对抗氧化应激。在发育中的多巴胺能神经元，Nurr1调控黏蛋白C基因表达。在离体和Nurr1基因敲除小鼠观察到存在低水平的黏蛋白C mRNA。微点阵分析黏蛋白C基因敲除小鼠显示Nurr1阳性细胞数目增加，在孕11.5 d时形成酪氨酸羟化酶(TH) 阳性的多巴胺能神经元。这表明黏蛋白C延缓Nurr1阳性神经前体细胞分化为多巴胺能神经元。该实验表明Nurr1是NSC向多巴胺能神经元分化和存活的关键调控因子。Shim等［2］从成体大鼠脑室下区和白质分离出神经前体细胞，用Nurr1过表达后促进神经前体细胞分化产生有功能的多巴胺能神经元。Kim等［3］详细分析在发育中的腹侧中脑，显示多巴胺祖细胞区域有Ngn2和Mash1表达，它们是碱性螺旋环螺旋(bHLH)转录因子。过表达Ngn2或Mash1诱导来源于中脑腹侧的神经祖细胞出现神经发生（产生新的神经元）。但即使在分裂素存在的情况下，Ngn2抑制细胞分裂及神经元产生。Mash1在保留神经发生潜力的同时，仍然允许神经祖细胞分裂。过表达Ngn2或Mash1来源的新生神经元没有表现出多巴胺神经元标记物（如TH）阳性，Nurr1过表达以剂量依赖方式增加了TH水平（但亦包含神经元和胶质细胞），提示Nurr1是TH神经元非特异性激活。同时转染Nurr1及Ngn2或Mash1导致小部分TH阳性神经元产生。该实验得出结论:多种转录因子促使神经祖细胞首先向神经元分化，然后再向多巴胺表型分化，然而可能需要更多的因子产生完全有功能的多巴胺神经元。

    1.2  垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)  已经有证据表明PACAP在神经系统发育中起作用。Hirose等［4］研究发现PACAP对神经干/祖细胞分化有细胞系选择决定作用。通过观察神经球（NSC悬浮生长形成神经球）的形成发现，PACAP抑制碱性成纤维成长因子（bFGF）诱导增殖（自我更新）。PACAP增加了微管相关蛋白2(MAP2)阳性神经元数目，但没有影响巢素(nestin，NSC标记物)、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，星形胶质细胞标记物)及CNP(少突胶质细胞标记物)阳性细胞数量。该实验表明PACAP抑制神经祖细胞的自我更新能力，而诱导其向早期神经元分化。

    1.3  生长因子和神经营养因子  Tarasenko等［5］研究不同的生长因子单独或联合运用［如表皮生长因子（EGF）、白血病抑制因子（LIF）、bFGF等］对人类NSC分化的影响。发现层黏连蛋白促进NSC向神经元分化；在含有EGF和bFGF组或EGF、bFGF和LIF组NSC显著分化产生胆碱能神经元。该实验结果提示人类NSC有很高的可塑性，其增殖和分化依赖不同的生长因子。Ren等［6］研究不同的培养基如何影响NSC分化成胆碱能神经元。NSC在含有bFGF和肝素的培养基中培养，可以检测到胆碱乙酰基转移酶(ChAT)阳性细胞，从而证实NSC分化为胆碱能神经元。当层黏连蛋白加入到含肝素的培养基中，出现更多的ChAT阳性细胞。该实验说明在培养基中bFGF和肝素对于NSC分化为胆碱能神经元是必须的，层黏连蛋白在此过程中是重要的积极因素。Calza等［7］用免疫毒素192IgG皂草素损毁大鼠基底前脑胆碱能系统（制成Alzheimer病损毁动物模型），并由脑室给予EGF或bFGF，为期14 d。14 d后给予神经生长因子(NGF)，为期14 d，同时由饮食途径给予维甲酸1个月。发现EGF和bFGF均能增加脑室下区增殖细胞（内源性NSC）数目。经水迷宫测验显示大鼠症状改善，海马胆碱乙酰转移酶活性增强。该实验表明分裂素、维甲酸、NGF处理可以作用于内源性NSC，达到胆碱能神经元脑修复。Ishii等［8］发现在脊髓损伤中，用抗睫状神经营养因子(CNTF)抗体阻滞CNTF可以减少移植的NSC分化，产生星形胶质细胞，促进皮质脊髓束纤维（宿主轴索）再生。

    1.4  维甲酸信号途径  在发育中的脊髓，维甲酸信号调控有丝分裂期后的运动神经元。Rao等［9］研究发现维甲酸诱导的基因GDE2，其编码6个跨膜蛋白在体内促进运动神经元祖细胞向脊髓运动神经元分化，而胞外催化区单个氨基酸突变使得该蛋白功能丧失。说明跨膜蛋白GDE2诱导体内运动神经元祖细胞向运动神经元分化。Goncalves等［10］研究发现维甲酸信号途径决定神经祖细胞的神经元标记物表达。维甲酸受体α(RARα)激活，主要形成星形胶质细胞和少突胶质细胞；而维甲酸受体β(RARβ)激活，形成运动神经元。在神经元发育中涉及到2种转录因子islet1/2，活化的RARβ上调islet1表达，活化的RARα与RARβ信号联合作用,维持islet1表达或在缺少活化的RARβ时诱导islet2表达。RARγ不直接调控islet1/2，但是可以下调RARβ表达。另外激活的RARα是发育成成熟的运动神经元表型所必须的最终步骤之一。

    1.5  其他  糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是成体NSC存活和分化的重要调控因子。Maurer等［11］研究大鼠脑室下区来源的NSC，当GSK3β被抑制时显示Wnt/β连环蛋白信号途径成分参与增强的NSC向神经元分化过程以及β连环蛋白靶基因转录激活。Wang等［12］研究发现胚胎小鸡骨骼肌提取物能诱导NSC分化产生大量的胆碱能神经元。

    2  影响NSC向少突胶质细胞分化的因素

    2.1  生长因子和细胞因子

    2.1.1  bFGF和EGF  Abematsu等［13］研究发现bFGF能使背侧端脑来源的神经祖细胞分化产生O4阳性的少突胶质细胞，但不能产生γ氨基丁酸能神经元。Ohori等［14］研究发现直接向损伤脊髓病变组织给予成纤维细胞生长因子2（FGF2）和EGF能诱导很大一部分绿色荧光蛋白(GFP)标记的内源性神经祖细胞表达幼稚神经元标记物，而且逆转录病毒介导过表达碱性螺旋环螺旋转录因子Neurogenin2和Mash1分别增强新生成熟的神经元和少突胶质细胞产生。Deleyrolle等［15］运用基因阵列策略研究内源性和外源性细胞因子对神经前体细胞生长和分化的联合作用。发现在生长期加入CNTF、骨形态发生蛋白(BMP)、γ干扰素(IFNγ)或肿瘤坏死因子α(TNFα)，NSC表达相应受体导致分化形成少突胶质细胞减少。FGF2/EGF调控NSC合成的内源性细胞因子参与NSC生长和分化。特别是BMP7和CNTF在NSC扩增时表达，但在分化时显著地由BMP7转向BMP4和BMP6，而且CNTF急剧增加。在CNTF基因敲除小鼠来源的神经球中研究内源性CNTF的作用，发现神经球生长加速伴随凋亡减少，GFAP阳性的星形胶质细胞产生减少。

    2.1.2  胰岛素样生长因子(IGF)  Hsieh等［16］研究发现IGFⅠ刺激成体大鼠海马来源的多能神经祖细胞向少突胶质细胞分化。这是通过抑制BMP信号介导实现。该实验表明在存在信号分子IGFⅠ影响多能神经祖细胞向少突胶质细胞系分化。IGF是少突胶质细胞存活有效的神经保护因子，IGFⅠ受体(IGFIR)是由位于细胞外的两条α链和跨膜的两条β链组成，它广泛分布于各种组织和细胞中，介导IGFⅠ促进细胞增殖和分化的作用。Broughton等［17］研究发现在高度富集NSC大规模产生的少突胶质细胞培养中，IGF介导的信号转导途径表现出成熟依赖性差异:相对于成熟的少突胶质细胞，IGFⅠ和胰岛素受体、胰岛素受体底物1(IRS1)、胰岛素受体底物2(IRS2)、蛋白激酶 B(PKB)/Akt和Janus激酶(JNK)在神经球和少突胶质祖细胞较高水平表达。在神经球向少突胶质细胞球分化过程中Erk表达显著增加，Erk的激活是抗凋亡信号。IGF激活的广泛增殖Erk途径在NSC分化期间逐渐获得，然而IGF激活的广泛存活前、抗细胞凋亡PI3K/PKB 途径在每个发育阶段始终很强。

    2. 2  神经营养因子3(NT3)  Hu等［18］发现给予NT3后24 h,来源于出生后小鼠海马的NSC向少突胶质前体细胞分化增多，向神经元分化减少，但不影响少突胶质前体细胞增殖和存活。NT3诱导一系列胞内反应,包括胞外信号相关激酶1/2(Erk1/2)或Akt磷酸化增强,少突胶质细胞系基因1表达增加（一种参与少突胶质细胞发育的转录因子）。应用U0126（一种Erk1/2上游区MEK1/2的特异性抑制剂），来阻滞Erk1/2磷酸化。少突胶质细胞系基因1表达受到抑制，阻止NT3刺激产生的NSC向少突胶质前体细胞分化反应。该实验表明NT3通过Erk1/2依赖途径提高少突胶质细胞系基因1表达，诱导NSC向少突胶质细胞分化。

    2.3  其他  Cui等［19］研究发现NB3（F3/接触蛋白家族的一种）作为一种Notch新的配体,参与少突胶质细胞产生。NB3触发Notch胞内区域核转运，通过Deltex1促进少突胶质前体细胞分化和少突胶质细胞生成。在原代少突胶质细胞，NB3增加了髓鞘相关糖蛋白转录产物。该实验得出结论经由Deltex1的NB3/Notch信号途径提高神经祖细胞向少突胶质细胞分化。因此，NB3/Notch信号途径可以作分子操作来治疗脱髓鞘性疾病。髓鞘转录因子1(Myt1)是一种锌指DNA结合蛋白，在神经祖细胞和少突胶质细胞系细胞表达。Nielsen等［20］研究2个推测的Myt1功能域:4锌指DNA结合功能域(4FMyt1)及中央蛋白相互作用域(CDMyt1)的作用。在分裂素存在的情况下， 4FMyt1抑制少突胶质祖细胞增殖，经形态学、免疫染色、髓鞘基因表达评价，4FMyt1抑制少突胶质祖细胞向少突胶质细胞分化。CDMyt1表达也有相似的抑制作用而过表达完整的Myt1仅表现出部分抑制作用。Redondo等［21］研究α氨基羟甲基恶唑丙酸/红藻氨酸盐受体对来源于大鼠纹状体的NSC分化作用的影响。应用红藻氨酸后显著增加磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)。该实验得出结论红藻氨酸刺激α氨基羟甲基恶唑丙酸受体促进NSC来源的少突胶质前体细胞增殖，这通过蛋白激酶A和C的CREB激活机制。而且红藻氨酸亦触发NSC向神经元分化。硫酸酯酶1是一种分泌酶，它调控硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的硫酸盐化作用。在脊髓腹侧，硫酸酯酶1调控Shh信号，引起腹侧神经祖细胞对增强的Shh蛋白浓度发生反应，从而促进其向少突胶质细胞分化［22］。

    总之，影响NSC分化的因素很多，机制复杂。治疗不同的神经系统疾病需要将NSC定向分化为不同合适类型的细胞，而且细胞群的纯度要高，这些在NSC治疗疾病和尽可能减少不良反应方面显得十分重要。需要深入理解NSC定向分化机制和各种具体定向诱导分化的处理方法。

【参考文献】  ［1］Sousa KM,Mira H,Hall AC,et al. Stem Cells,2007,25:511.

［2］Shim JW,Park CH,Bae YC,et al. Stem Cells,2007,25:1252.

［3］Kim HJ,Sugimori M,Nakafuku M,et al. Exp Neurol,2007,203:394.

［4］Hirose M,Hashimoto H,Iga J,et al. Ann N Y Acad Sci,2006,1070:342.

［5］Tarasenko YI,Yu Y,Jordan PM,et al. J Neurosci Res,2004,78:625.

［6］Ren W,Guo Q,Yang Y,et al.Neurol Res,2006,28:87.

［7］Calza L,Giuliani A,Fernandez M,et al. Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:7325.

［8］Ishii K,Nakamura M,Dai H,et al. J Neurosci Res,2006,84:1669.

［9］Rao M,Sockanathan S.Science,2005,309:2212.

［10］Goncalves MB,Boyle J,Webber DJ,et al.Dev Biol,2005,278:60.

［11］Maurer MH,Bromme JO,Feldmann RE Jr,et al. J Proteome Res,2007,6:1198.

［12］Wang TT,Jing AH,Luo XY,et al. Neuroreport,2006,17:1433.

［13］Abematsu M,Kagawa T,Fukuda S,et al. J Neurosci Res,2006,83:731.

［14］Ohori Y,Yamamoto S,Nagao M,et al. J Neurosci,2006,26:11948.

［15］Deleyrolle L, MarchalVictorion S, Dromard C, et al. Stem Cells，2006,24:748.

［16］Hsieh J,Aimone JB,Kaspar BK,et al. J Cell Biol,2004,164:111.

［17］Broughton SK,Chen H,Riddle A,et al. J Neurochem,2007,100:628.

［18］Hu X,Jin L,Feng L. J Neurochem,2004,90:1339.

［19］Cui XY,Hu QD,Tekaya M,et al. J Biol Chem,2004,279:25858.

［20］Nielsen JA,Berndt JA,Hudson LD,et al. Mol Cell Neurosci,2004,25:111.

［21］Redondo C,LopezToledano MA,Lobo MV,et al. J Neurosci Res,2007,85:1170.

［22］Danesin C,Agius E,Escalas N,et al. J Neurosci,2006,26:5037.