抑肽酶对大鼠脑出血血肿周围组织核转录因子表达的影响

抑肽酶对大鼠脑出血血肿周围组织核转录因子表达的影响作者：杨德刚    作者单位：225001 扬州，苏北人民医院神经内科     【摘要】  目的 探讨抑肽酶（ATG）对大鼠脑出血血肿周围组织核转录因子（NF）κB p65表达的影响。方法 采用立体定向手术脑尾状核胶原酶注射制备大鼠脑出血（ICH）模型，随机分为ICH组、ATG组和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）组；分别于制模后6 h、24 h、72 h、7 d应用免疫组化法及逆转录聚合酶链反应法检测血肿周围脑组织NFκB p65蛋白及mRNA的表达。结果 各组NFκB阳性细胞数制模后24 h明显增加，72 h达高峰，随之下降。NFκB阳性细胞数在ICH组和ATG组各时间点差异无统计学意义；PDTC组ICH 24 h～7 d较ICH组和ATG组显著下降(Ｐ<0.05～0.001)；各组NFκB mRNA表达在ICH 24 h达到高峰，72 h稍下降，7 d下降至术前水平。ICH组和ATG组 NFκB mRNA表达各时点间差异无统计学意义；与ICH组及ATG组相比，PDTC组ICH 24 h后显著下降(Ｐ<0.05～0.001)，7 d时显著低于术前水平（Ｐ<0.01）。结论ATG对ICH后脑组织NFκB p65表达无明显抑制作用，其抗炎与抗凋亡作用可能是通过其他途径实现的。    【关键词】  脑出血,抑肽酶,核转录因子,吡咯烷二硫代氨基甲酸盐    Effect of aprotinin on nuclear factorκB expression in brain regions around the hematoma of intracerebral hamorrage in rats  YANG Degang, Chen Yingzhu, WU Bihua, et al. Department of Neurology, the Subei Peoples Hospital， Yangzhou 225001,China    Abstract：Objective  To investigate the effect of aprotinin on nuclear factorκB p65 expression in brain regions around the hematoma of intracerebral hamorrage (ICH)in rats. Methods  ICH models were induced utilizing the local injection of collagenase into the basal ganglia with sterile technique and divided into ICH group, aprotinin group(ATG) and Pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC) group. The expression levels of  NFκB p65 protein and mRNA were detected by immunohisochemistry or RTPCR at 6 h，24 h，72 h，7 d  after injection. Results  The amount of NFκB positive cells increased greatly at 24 h following ICH, peak at 72 h, then decreased in each group. There was no  markedly different from ICH group to ATG group, but PDTC group were singnificantly decreased after ICH 24 h～7 d than groups ICH and ATG(P<0.05～0.001).The  level of NFκB p65 mRNA reached the peak at 24 h, then dicreased lightly at 72 h and to the preoperative level at 7 d following ICH in each group. There was not a significant difference of expression of  NFκB p65 mRNA between groups ICH and  ATG. In PDTC group, the expression of NFκB p65 mRNA dicreased markly at 24 h following ICH compared with groups  ICH and ATG (P<0.05～0.001),and less than the preoperative level at 7 d (P<0.01).Conclusions  ATG cant inhibit the expression of NFκB p65, other pathways are possiblly involved in the inhibitory machanism of ATG on the inflammation and apoptosis following ICH.    Key words：intracerebral hemorrhage；aprotinin；nuclear factorκB； Pyrrolidine dithiocarbamate    脑出血（ICH）后继发性损伤是影响患者预后的重要因素之一，炎症反应、细胞凋亡参与了这一病理过程［1］。细胞内的核转录因子（NF）κB参与了机体的免疫、防御、炎症反应及细胞凋亡等病理过程［2］ 。抑肽酶（ATG）能明显抑制中性粒细胞的浸润及血肿周围白介素（IL）1β的表达，减轻ICH后的炎症反应。为探讨ATG的抗炎作用是否与抑制NFκB的表达有关。本研究选用ATG对ICH 模型进行干预，并与吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC，一种NFκB特异性抑制剂）的干预进行对比，探讨ATG对ICH模型鼠脑组织NFκB的蛋白、mRNA表达的影响。1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  动物及分组  健康雄性Wistar大鼠144只，质量200～250 g，随机分为ICH组、ATG组和PDTC组，各组再分成ICH 6 h、24 h、72 h、7 d 4个亚组，每亚组12只。    1.1.2  主要仪器与试剂  动物立体定向仪（西安光学医疗器械公司）；10 μl微量注射器（上海保西玻璃仪器厂）；PCR扩增系统(Gene/PCR System 2400，Perrin Elmer,USA）；即用型SP免疫组化染色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；鼠AntiNFκB p65（Santa Cruz Biotechnology）；βactin引物（上海生工生物技术公司合成公司）。    1.2  方法    1.2.1  动物模型制作  参照Grossetete等［3］方法，大鼠禁食12 h后用3.5%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔注射麻醉并固定于立体定向仪上。头皮正中切口约1.5 cm，于颅骨背侧前囟后0.2 mm、中线向左旁开3.0 mm处钻孔，微量进样器沿钻孔垂直进针约5.2 mm。缓慢注入含有Ⅶ胶原酶(0.5 U/2 μl)的生理盐水2 μl，10 min内注射完毕，留针5 min后缓慢退出以骨蜡封闭针孔，然后缝合头皮。    1.2.2  药物干预  术后2 h ATG组给予ATG（5万KIU/ml），按5万KIU/100 g用微量注射泵经尾静脉推注；ICH组给予等量生理盐水尾静脉注射；PDTC组按1 ml/100 g给予PDTC药液（200 mg/1 ml）腹腔注射；均为每日1次，直至处死日。    1.2.3  免疫组化染色  各组在相应时间点取动物6只，过量麻醉后迅速打开胸腔，经左心室穿刺，生理盐水250  ml快速灌注冲洗，继以4%多聚甲醛灌注固定。断头取脑连续作冠状切片，厚度约2 mm，放入4%多聚甲醛浸泡固定6～24 h，包埋固定后脑组织经切片机切厚为6 μm切片，用SP法进行免疫组化染色。显色后，胞浆胞核均为棕黄色的为NFκB p65阳性细胞，400倍光镜下观察并计数血肿周围5个连续不重复视野阳性细胞数，取6张切片的平均值。    1.2.4  RTPCR  各组各时间点取6只动物，麻醉后迅速断头取脑，切取血肿周围脑组织约100 mg置于液氮中保存备用。准确称取100 mg脑组织，按Trizol说明书进行RNA提取。cDNA合成：反应管中加入DEPC水9.5 μl、25 mmol/L MgCl2 l5 μl、10×buffer 2.5 μl、10 mmol/L dNTP 2.5 μl、Rnasin 0.5 μl、MMLV 1 μl、 Oligo dT 1.5 μl、RNA 2.5 μl共25 μl，反应条件：70℃ 5 min；37℃ 60 min；90℃5 min；0℃ 10 min。扩增：NFκB上游引物5′ACA CTT AGC CAT CAT CCA CC3′，下游引物5′CAG CCA GCC AAG GAG ATG TT3′。50 μl  PCR反应体系包括：双蒸水35.7 μl、10×buffer 5 μl、25 mmol/L、MgCl2l 3 μl、NFκB上游引物（25 pmol/ml）1 μl 、NFκB下游引物（25 pmol/ml）1 μl、βaction上游引物（25 pmol/ml）1 μl、βaction下游引物（25 pmol/ml）1μl、cDNA 2 μl 、Taq聚合酶0.25 μl。反应条件：95℃ 5 min；94℃ 40 s；58℃ 50 s；72℃  1 min；32个循环；72℃ 7 min。所得产物储存于-20℃冰箱，24 h内在1.5%琼脂糖凝胶上行电泳、照相。    1.2.5  RTPCR鉴定及电泳分析  取RTPCR扩增产物10 μl，溴酚兰上样缓冲液2 μl混合加入样品孔中，电泳，恒压110 mV，40 min，再在0.5 mg/ml溴化乙啶溶液中漂洗20 min，最后用图像分析仪测定其光密度值（OD）。用以恒量表达βaction 的OD值为内参照校正，各样本的基因表达量用其扩增后产物在凝胶条带的OD值与βaction基因条带的OD值之比即NFκB OD值/βaction OD值，半定量表示。    1.2.6  统计学方法  数据采用SPSS 10.0统计软件包进行统计学分析，各组数据结果用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。2  结  果    2.1  各组脑组织NFκB阳性细胞数的比较  见表1。各组造模后6 h脑组织可见NFκB阳性细胞的表达，72 h达到高峰，7 d时仍见有较多NFκB阳性细胞。ATG组与ICH组各时间点NFκB阳性细胞数差异无统计学意义；与ATG组及ICH组比较，PDTC组在ICH 24 h～7 d明显下降 (Ｐ<0.05～0.001)。表1  各组大鼠脑组织NFκB阳性细胞数的比较注：与ICH组比较Ｐ<0.001；与ATG组比较*Ｐ<0.05，△Ｐ<0.01    2.2  各组大鼠脑组织NFκB mRNA表达的比较  见表2。各组脑组织NFκB mRNA表达在ICH 24 h表2  各组大鼠脑组织NFκB mRNA表达的比较 注：与ICH组比较 Ｐ<0.001；与ATG组比较*Ｐ<0.05， △Ｐ<0.01    达高峰，72 h稍下降，7 d时明显下降。ATG组与ICH组各时间点NFκB mRNA表达差异无统计学意义；PDTC组在ICH 72 h 时明显低于24 h、7 d时降低更明显 (Ｐ<0.05～0.001)。3  讨  论    研究［1］证实炎症反应、细胞凋亡在继发性脑损伤中起重要作用，主要包括：白细胞的浸润，炎症细胞因子的释放，以及补体系统的激活。NFκB是从B淋巴细胞核中提取到的一种与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异结合的核蛋白因子，以多肽p50～p65同源或异源二聚体的非活性形式存在于几乎所有类型细胞胞质中。NFκB是重要的转录因子，与包括组织生长和组织内环境稳态维持的多种生物过程有重要关系；能够控制正常细胞和恶性细胞的凋亡，因此核因子对于抗癌、抗炎治疗是一种富有挑战性的干预靶点［4］。中枢神经系统尤其是大脑皮质和海马神经元内有高结构型活性的NFκB，在胶质细胞胞浆中存在非活性的NFκB。NFκB通常以无活性的形式存在于胞浆内，被激活后快速移入核内，在ICH的继发性损伤信号传导中起重要作用［5］。    本研究发现， ICH后24 h NFκB阳性细胞数明显增加，72 h达高峰， 7 d时仍有表达；RTPCR检测发现ICH 6 h血肿周围组织NFκB mRNA即表达，24 h达高峰， 7 d已经明显减弱，与免疫组织化学法检测到NFκB阳性细胞的变化类似，说明ICH早期即有NFκB的激活；NFκB mRNA表达高峰在ICH后24 h,而炎症反应高峰在ICH后48 h，与国内董钊等［6］研究相似，提示其可能参与介导ICH后的炎症反应。因此抑制NFκB的表达很可能会成为抑制ICH后炎症反应的重要途径。ICH 7 d时NFκB蛋白表达仍比ICH 6 h有显著增加，说明NFκB在ICH后的表达至少持续1周时间，这与Zhao等［7］研究结果相似；也提示针对ICH后NFκB的治疗时间窗至少1周。    ATG能够通过多种途径减轻炎症反应，如：直接抑制细胞间黏附分子（ICAM）1、L选择素（Lselectin）的表达，抑制白细胞和内皮细胞间的相互作用，减少白细胞的浸润；还可抑制氧自由基、髓过氧化物酶、IL1β的释放；直接抑制凝血酶、缓激肽释放酶等的活性；还能够抑制补体C5a活化，抑制补体系统的激活，发挥良好的抗炎作用［8］。    PDTC是NFκB特异性抑制剂，是抗氧化剂。近年体外实验［9］发现它能够选择性抑制NFκB的活化及致炎细胞因子表达和释放。Zhou等［10］研究发现兔蛛网膜下腔出血时，PDTC能够抑制基底动脉NFκB表达，抑制肿瘤坏死因子α、IL1β、ICAM1和血管内皮细胞黏附分子1等炎性因子的表达，从而减轻炎症反应诱导的血管痉挛。    本研究ICH大鼠用ATG干预后NFκB的表达在各时间点无明显的变化，提示ATG在ICH后的抗炎和抗神经元凋亡作用与NFκB的表达变化缺乏密切关系，其抗炎与抗凋亡作用是通过其他途径实现的。这也提示ICH后ATG干预仅能减轻而不能完全阻断炎症的发生与发展，并且其所起的作用与NFκB表达的变化无明显相关性。ICH后予以PDTC干预，可明显减少脑组织NFκB阳性细胞数，表明PDTC能够明显抑制ICH周围脑组织NFκB的表达。由此，可以设想ATG和PDTC联合治疗ICH有望取得更理想的疗效。【参考文献】［1］吴家幂，周向阳，储照虎，等.实验性脑出血后脑组织核因子кB表达和含水量的变化及其相关性［Ｊ］.临床神经病学杂志,2007,20:128.［2］Yates LL, Górecki DC. The nuclear factorkappaB (NFkappaB):from a versatile transcription factor to a ubiquitous therapeutic target［J］. Acta Biochim Pol,2006,53:651.［3］Grossetete M, Rosenberg GA. Matrix metalloproteinase inhibition facilitates cell death in intracerebral hemorrhage in mouse［OL］. J Cereb Blood Flow Metab, 2007,Oct:31(Epnb).［4］Kulms D, Schwarz T. NFkappaB and cytokines［J］.Vitam Horm, 2006,74:283.［5］Wagner KR. Modeling intracerebral hemorrhage: glutamate, nuclear factorkappa B signaling and cytokines［J］. Stroke, 2007,38(Suppl 2):S753.［6］董钊，石铸, 王璐,等.高血压脑出血患者急性期血肿周围组织的炎症反应特征［J］.临床神经病学杂志，2007，20：249.［7］Zhao X, Zhang Y,Strong R,et al. Distinct patterns of intracerebral hemorrhageinduced alterations in NFkappaB subunit, iNOS, and COX2 expression［J］. J Neurochem, 2007,101:652.［8］Asimdkopoulos G,Lidington EA,Mason J, et al. Effect of aprotinin on endothelial cell activation［J］. J Thorac Cardiovasc Surg,2001,122:123.［9］Cuzzocrea S, Chatterjee PK,Mazzon E, et al. 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