硬膜外腔阻滞麻醉对脊髓生物学影响的实验研究

　　作者：张勇， 吴静，甘子明 作者单位：(新疆医科大学　第五附属医院麻醉科，基础医学院解剖教研室, 新疆乌鲁木齐830011)

　　【摘要】 目的探讨硬膜外腔阻滞麻醉对脊髓神经细胞的生物学影响。方法选用健康新西兰大白兔30只，随机分为实验组和对照组，每组15只。用2%戊巴比妥纳按30 mg/kg，从兔耳缘静脉注射作基础麻醉。实验组用1%利多卡因作兔腰骶段硬膜外腔阻滞麻醉，对照组用生理盐水代替麻醉药。于麻醉后30 min灌注与取材固定，蜡块包埋标本，切片处理，HE染色，免疫组织化学染色，图像采集分析及统计处理。结果(1)硬膜外阻滞麻醉后，实验组相应节段脊髓灰质后角Ⅲ、Ⅳ板层的小圆细胞及前角Ⅸ板层外侧大多角细胞经HE染色后均有胞浆尼氏体减少，胞核偏向一端，其细胞形态改变与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);(2)免疫组织化学染色后，对照组上述细胞有cfos蛋白表达，实验组上述细胞cfos蛋白表达减弱或无表达，对照组与实验组表达量比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)腰骶段硬膜外腔阻滞麻醉后，脊髓软脊膜没有水肿或分层，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论硬膜外阻滞麻醉后，脊髓相应节段的神经细胞的功能受到抑制。硬膜外腔阻滞麻醉后，脊髓软脊膜没有水肿或分层现象。

　　【关键词】 硬膜外腔， 麻醉，脊髓神经细胞， 生物学影响

　　Epidural anesthesia on the biological effects of experimental spinal cord research

　　ZHANG Yong, WU Jing, GAN Ziming

　　(Department of Anaesthesiology, Fifth Affliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: ObjectiveTo investigate the biological effects of epidural anesthesia through observation of the spinal cord nerve cells of the biological effects. MethodsThirty healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into experimental and control group, 15 in each group. With 2% satisfied by pentobarbital 30 mg/kg, from the edge of rabbit ears for the basis of intravenous anesthesia. Experimental group with 1% lidocaine for rabbit lumbosacral epidural anesthesia, the control group with normal saline in place of anesthetics. 30 min after anesthesia and perfusion based on fixed, paraffinembedded block samples, biopsy processing, HE staining, immunohistochemistry, image analysis were used to observe. Results(1) Epidural anesthesia, the experimental group the corresponding spinal dorsal horn gray matter Ⅲ, Ⅳ lamellar of small round cells, anterior horn of lateral lamellar Ⅸ most horn cells by HE staining Nissl bodies were reduced, one end of the nuclear bias, the cell morphological changes compared with the control group were statistically significant differences (P<0.05); (2) Immunohistochemistry, the control group, these cells cfos protein expression, compared with the experimental group were statistically significant differences (P<0.05). (3) Lumbosacral epidural anesthesia, the spinal cord is not layered or soft spinal fracture compared with the control group no statistically significant difference (P>0.05). ConclusionAfter epidural anesthesia, the corresponding segment of the posterior horn of the spinal cord gray matter Ⅲ, Ⅳ lamellar of small round cells, anterior horn of lateral lamellar Ⅸ most horn cells to reduce the Nissl bodies, tend to end nuclear, cfos protein expression reduced or no expression. It sugguests that the corresponding segments of spinal cord nerve cells by inhibiting the function. After epidural anesthesia, spinal cord does not have a layered soft or breakage.

　　Key words: peripheral nerve; anesthesia; spinal nerve cells; biological effects

　　疼痛感觉是通过神经反射传导到大脑皮质来实现的。简单神经反射由感受器、传入神经、低级中枢(脊髓)、传出神经、效应器组成;复杂神经反射则由低级中枢向高级神经中枢传导整合来完成的。本研究采用硬膜外腔阻滞麻醉的方法制备新西兰大白兔硬膜外腔阻滞模型，观察兔相应节段脊髓的病理变化及cfos蛋白的表达情况，寻找周围神经阻滞麻醉后对中枢神经脊髓神经细胞形态和功能改变的关系，以指导临床麻醉的实践。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物及分组

　　健康新西兰大白兔30只(雌雄不限，分笼饲养，新疆医科大学实验动物中心提供)，体重3.0~4.0 kg，置于安静、温暖(20~23℃)、避强光的环境中饲养2 d。随机分为实验组和对照组，每组15只。

　　1.2　主要试剂

　　盐酸利多卡因注射液 ( 2%，上海禾丰制药有限公司生产，产品批号：071011)。一抗试剂盒即cfos (兔抗兔)(0.1 ml，武汉博士德生物制品有限公司生产)。二抗试剂盒即SP(羊抗兔)(3 ml，北京中山金桥生物科技制品有限公司生产)。显色试剂盒即DABkit(3 ml，北京中山金桥生物科技制品有限公司生产)。

　　1.3　方法

　　1.3.1　动物模型制备

　　取新西兰大白兔，称重。用兔绳绑兔四肢俯卧位固定于手术台上，用2%戊巴比妥纳按30 mg/kg，从兔耳缘静脉注射作基础麻醉。硬膜外麻醉穿刺定位：于L56/L67棘突侧缘进针穿刺到硬膜外腔有负压并且无脑脊液流出后注射溶液2 ml。实验组注射2%利多卡因2 ml,对照组注射生理盐水2 ml。溶液中均加2滴亚甲蓝，以便在解剖时观察药液是否注射进入硬膜外腔。经解剖证实，2%利多卡因和生理盐水均注射到硬膜外腔。将兔仰面固定在手术台上，从胸骨左缘逐层切开，打开胸腔，暴露心脏，于心尖用12号针穿刺进入左心室，止血钳固定,用组织剪打开右心房放血,向左心室快速静脉注射生理盐水500 ml, 然后快速静脉注射4%多聚甲醛溶液1 000 ml，清水冲净后放到大白盘中。

　　1.3.2　标本处理

　　解剖脊柱，分离腰骶干脊髓及其脊神经节，并将其固定于4%多聚甲醛溶液中。将固定标本取脊髓腰5、腰6、腰7节段脊髓及相应节段神经节包埋在液体蜡中，凝固后做好编号。将蜡块修整好，在相应节段脊髓标本及神经节做横切面切片，约4 μm厚度，放在玻片中烤蜡、脱水。HE染色，免疫组化常规。

　　1.3.3　图像采集分析

　　HE染色图片：在显微镜下，分别用4、10、20、40倍观察脊髓腰5、6、7节段的脊髓的软脊膜的改变，脊髓后角第Ⅲ、Ⅳ板层及脊髓前角第Ⅸ板层外侧神经细胞形态，神经节细胞的形态。随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个神经细胞中阳性细胞数，取其平均数为该标本的细胞阳性数。计算阳性率，再将其转换为半定量数值，使之转换为计量资料。脊髓软脊膜的变化是定性资料，数量偏少，无法进行半定量转换。免疫组化图片：在显微镜下，分别用4、40倍观察脊髓腰5、6、7节段脊髓后角第Ⅲ、Ⅳ板层，脊髓前角第Ⅸ板层外侧神经细胞的免疫组化切片形态。细胞浆、细胞核呈棕黄色颗粒为阳性。随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个神经细胞中阳性细胞数，取其平均数为该标本的细胞阳性数。计算阳性率，再将其转换为半定量数值，使之转换为计量资料。

　　1.4　统计学处理

　　采用SPSS 11.0统计软件对实验数据进行统计分析，对资料进行方差齐性检验，若方差齐进行t检验;若不齐进行t’检验或wilcoxon秩和检验。软脊膜水肿的统计因理论数(T):1≤T< 5或T≤1，采用四格表资料的确切概率法统计，检验水准α=0.05。

　　2　结果

　　2.1　2组脊髓神经细胞HE染色后形态变化比较

　　实验组脊髓灰质后角Ⅲ、Ⅳ板层的小圆细胞，前角Ⅸ板层外侧大多角细胞均有胞浆尼氏体减少，胞核密度减低，胞核偏向一端(图1~2)。实验组的阳性细胞数比对照组的阳性细胞数明显增多，其细胞形态改变与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。表1　2组脊髓神经细胞HE染色后形态变化比较 (略)

　　2.2　2组脊髓神经细胞cfos蛋白表达比较

　　对照组脊髓灰质后角Ⅲ、Ⅳ板层的小圆细胞及前角Ⅸ板层外侧大多角细胞有棕黄色颗粒阳性反应，密度分布均匀，色度较深，核仁浓缩呈深棕黄色，cfos表达阳性(图3)。实验组阳性表达减弱或无表达(图4)。实验组在细胞浆、细胞核中的表达量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。表2　2组脊髓神经细胞中cfos蛋白表达比较 (略)

　　3　讨论

　　浅部感觉传导路是躯干、四肢部皮肤到周围突，从脊神经、脊神经节、中枢突，经后根入脊髓上升1~2个节段到后角固有核。运动传导通路由上运动神经元和下运动神经元组成。上运动神经元为位于大脑皮质的投射至脑神经一般躯体和特殊内脏运动核及脊髓前角运动神经元的运动神经细胞。下运动神经元为脑神经一般躯体和特殊内脏运动核和脊髓前角的运动神经细胞。躯体运动传导主要为锥体系和椎体外系。至脊髓的皮质脊髓侧束沿途发出侧支，逐节终止于脊髓前角细胞(可达骶节)，主要支配四肢肌。本研究在下肢的痛温觉和运动在脊髓横截面上分别观察脊髓灰质后角板层Ⅲ、Ⅳ及前角板层Ⅸ区的神经细胞。兔的脊髓有颈1~8、胸1~12、腰1~7及骶尾部[1]。棘突间是骨性连接。两侧髂前上嵴连线横过腰椎6~7间隙。因此在实验穿刺中依此为定位标志，并采用侧路法穿刺 [2] 。本研究对兔腰骶段硬膜外腔神经阻滞麻醉后，选择腰椎5、6、7节段脊髓后角Ⅲ、Ⅳ板层及脊髓前角Ⅸ板层外侧神经细胞进行观察。观察细胞浆、细胞核HE染色后的尼氏体变化，免疫组化后的cfos的表达。

　　3.1　局麻药

　　局麻药是应用于神经末梢或神经干、能可逆性阻断感觉神经冲动的发生和传导的药物。有在局部发生感觉(痛温觉)及运动(肌力)消失的效果。应用后对神经或肌肉无损伤，其麻醉范围小，不良反应少，较安全。目前局麻药产生神经阻滞的确切机制尚不清楚，在表面电荷学说、膜膨胀学说和受体部位学说中，又以受体部位学说受重视。该学说认为，局麻药是通过对神经细胞膜钠通道的阻滞，使钠通道失活来阻滞神经传导。

　　3.2　周围神经阻滞麻醉与尼氏体的关系

　　硬膜外阻滞麻醉后实验组腰椎5、6、7节段脊髓后角Ⅲ、Ⅳ板层小细胞及脊髓前角Ⅸ板层外侧大多角细胞HE染色显示胞浆尼氏体减少，向外周移位，细胞核密度减低，核偏向一端。对照组脊髓神经细胞胞浆尼氏体分布均匀，胞核密度均匀无偏移。说明局麻药阻断神经信号的刺激后，脊髓神经细胞中的尼氏体减少，并向外周分布。尼氏体光镜下呈嗜碱性的颗粒或小块状。不同神经元的尼氏体的形状、数量和大小不一。一般大神经元，尤其是大运动神经元的尼氏体丰富而粗大，犹如虎皮斑纹样;小神经元的尼氏体则较小而少。电镜下，尼氏体是由平行排列的粗面内质网和游离核糖体构成的。神经元在兴奋传导过程中，不断消耗某些蛋白质物质，尼氏体可合成新的蛋白质以补充这种消耗[3]。当代谢功能出现障碍时，尼氏小体的形态可发生变化。神经元损伤、过度疲劳和衰老时，均能引起尼氏体的减少、解体，甚至消失[4]。 本实验中，经过周围神经阻滞麻醉后，脊髓神经细胞的尼氏体减少。坐骨神经横断常致脊髓前角运动神经元发生轴突反应,形态上表现为尼氏体溶解、核偏位等改变[5]。本实验中的神经细胞尼氏体向周围分布，细胞核偏向一端，提示细胞功能受到抑制。尼氏体溶解时细胞受损,胞浆内成分水解,损害不重时可以完全恢复，因此它是神经元的急性可逆性变性过程[6]。尼氏染色中尼氏体受染后呈块状(形如虎斑) 或颗粒状,核周围尼氏体颗粒较大,近边缘处较小而细长,如在生理情况下,尼氏体大而数量多,反映神经细胞合成蛋白质的功能较强,在神经元受损时,尼氏体的数量可减少甚至消失。通过尼氏染色后对尼氏体的观察来了解神经元的损伤 [7]。因此，麻醉作用后，神经细胞的尼氏体逐渐减少，向核周围分布[7]，正常麻醉是一个可逆的过程。

　　3.3　周围神经阻滞麻醉与cfos表达之间的关系

　　本研究显示，硬膜外阻滞麻醉后，采用免疫组化SP法观察兔腰椎5、6、7节段脊髓后角Ⅲ、Ⅳ板层的小细胞及脊髓前角Ⅸ板层外侧大多角细胞的cfos表达。对照组脊髓神经细胞cfos阳性表达，显示染成棕黄色颗粒，大部分为胞浆着色，胞核也有着色。阻滞麻醉后的脊髓神经细胞免疫组化表达不明显或阴性。cfos基因是即刻早期基因(immediate early gene ,IEG),正常生理情况下在多种细胞中均有低水平的表达，起到参与细胞的生长、分化、信息传导等生理功能。其特征为静止的细胞在受到外界多种刺激时能快速、早期表达[8]。一些研究发现,多种麻醉药(包括静脉全麻药、吸入全麻药、局麻药)单纯给药均可引起中枢神经系统cfos基因的表达，但表达的程度和部位有不同差异。局麻药可阻断神经冲动的传导，cfos基因表达减弱。研究表明，伤害性刺激诱导的cfos在CNS中的表达多数情况下可被麻醉药所抑制[10]。本实验结果进一步说明外周神经阻滞麻醉可以抑制脊髓神经细胞中cfos的蛋白表达。

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