头孢曲松钠对谷氨酸诱导脑皮质神经元损伤的影响

头孢曲松钠对谷氨酸诱导脑皮质神经元损伤的影响作者：刘春华,王维治    作者单位：150086哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科    【摘要】  目的 探讨头孢曲松钠对谷氨酸诱导脑皮质神经元损伤的影响。方法 体外培养的大鼠脑皮质神经元分为头孢曲松钠（A）组、谷氨酸（B）组、头孢曲松钠预处理（C）组和对照（D）组；观察各组细胞形态变化；四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞活性；激光共聚焦显微镜观察静息及短暂细胞内钙超载状态下细胞内Ca2+变化；逆转录-聚合酶链技术检测谷氨酸转运体1（GLT1）mRNA表达。结果 与B组比较，C组神经元形态更接近正常；吸光度值A组、B组、C组、D组分别为0.795±0.010、0.624±0.028、0.738±0.021、0.813±0.023，B组及C组明显低于D组，但C组明显高于B组（均P<0.001）；细胞Ca2+平均荧光强度静息状态下A组、B组、C组、D组分别为127.329±12.086、281.400±21.378、220.171±24.061、141.257±6.165，C组明显低于B组（P<0.001），短暂细胞内钙超载时C组较B组上升缓慢但恢复迅速，GLT1mRNA表达增加（P<0.001）。结论 头孢曲松钠通过上调GLT1 mRNA表达拮抗细胞内钙超载，减轻谷氨酸的神经毒性作。    【关键词】  头孢曲松钠,谷氨酸,细胞内钙,谷氨酸转运体    Effect of Ceftriaxone on glutamate-induced cerebral cortical neurocyte injury　LIU Chun-hua, WANG Wei-zhi.　　Department of Neurology,the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,  Harbin 150086, China    Abstract：Objective  To study the effect of Ceftriaxone on glutamate-induced neurocyte injury. Methods  Cultured rat cerebral cortical neurocytes were divided into  Ceftriaxone （A）group, glutamate（B） group ,Ceftriaxone-pretreated （C） group and control （D） group. Observe morphous and MTT colorimetry were used to detect cytoactive. Laser scanning confocal microscope was used to measure the change of Ca2+ in rest state and after brief glutamate-induced Ca2+ loading. RT-PCR was used to determine the change of GLT1 mRNA expression.Results  Compared with B group, cellular morphous was closer to normal in C group. Absorptance values of groups A,B,C,D were 0.795±0.010, 0.624±0.028, 0.738±0.021 and 0.813±0.023, respectively, which there were lower in  groups B and C compared with group D, but absorptance value was higher in group C than that in group B（allP<0.001）. Mean fluorecence intensity of intracellular Ca2+ in groups A,B,C and D were127.329±12.086, 281.400±21.378, 220.171±24.061 and141.257±6.165, respectively, which was lower in group C than that in  group B（P<0.001）. Calcium levels increased slowlier and restored faster after brief glutamate-induced Ca2+ loading, and expression of GLT1 mRNA was much higher in group C than that in  group B（P<0.001）.Conclusion  Ceftriaxone can resist Ca2+ loading and reduce glutamate neurotoxicity.    Key words：Ceftriaxone；glutamate；intracellular calcium；glutamate transporters    在诸多急慢性中枢神经系统损伤中（癫疒间，脑缺血，脑外伤，肌萎缩侧索硬化症等），谷氨酸可通过细胞内钙超载等一系列级联反应导致神经细胞损伤。人们试图应用钙通道阻滞剂、谷氨酸受体拮抗剂等减轻谷氨酸导致的脑损伤，但临床疗效不尽人意。本研究通过观察头孢曲松钠对谷氨酸诱导的神经细胞损伤的影响，为临床寻找新的脑保护药物。1  材料与方法　　1.1  材料 　　Wistar乳鼠30只（本院动物实验中心）；头孢曲松钠（上海新先锋药业）;L-谷氨酸、胎牛血清（Sigma公司）；DMEM高糖培养基（Gibco公司）;四甲基偶氮唑盐（MTT，杭州四季青生物工程材料有限公司）；Trizol、Thermoscript TM RT-PCR试剂盒（Invitrogen公司）；RT-PCR引物（上海生工公司）；Fluo-3/AM、Pluronic-F127（日本同仁化学研究所）。　　1.2  方法　　1.2.1  细胞培养 　　根据Guillet等［1］方法并加以改良。无菌分离出生48 h内Wistar乳鼠大脑皮质，PBS冲洗、0.25%胰蛋白酶中剪碎后，37℃充分消化30 min。吸弃表面胰蛋白酶，加入倍量含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液终止消化；1000 r/min离心3 min，弃上清液，加入培养液制成1×107的单细胞悬液，接种于涂有多聚赖氨酸的50 ml培养瓶或96孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养，48 h全量换液，此后每周2次半量换液，倒置显微镜观察细胞形态变化。　　1.2.2  实验分组及处理 　　（1）头孢曲松钠（A）组：细胞经如上培养至8 d时，加入含头孢曲松钠培养液（终浓度1 mmol/L）培养2 d，PBS冲洗后正常培养24 h；（2）谷氨酸（B）组：细胞经如上培养至10 d时，加入含谷氨酸培养液（终浓度50 mmol/L）培养15 min后，换正常培养液继续培养24 h；（3）头孢曲松钠预处理（C）组：细胞经如上培养至8 d时，加入上述含头孢曲松钠培养液培养2 d，PBS冲洗后处理同B组；（4）对照（D）组：经如上正常培养11 d的细胞。　　1.2.3  细胞活性检测 　　采用MTT比色法。调节各组细胞以1×104密度接种在96孔板,每组7孔。每孔加入5% MTT 20 μl，37℃培养6 h后换100 μl二甲基亚砜溶解震荡5 min，酶标仪（波长492 nm）测各孔吸光度值。吸光度值越大细胞活性越高。　　1.2.4  细胞内Ca2+测定 　　避光条件下，将各组培养的细胞接种在96孔板，每组5孔。PBS冲洗后，各孔加入含有Fluo-3/AM（终浓度4 mmol/L）和Pluronic-F127（终浓度0.05%）无血清DMEM培养液（每孔100 μl），37℃孵育45 min。不含荧光探针PBS液充分冲洗后加入细胞外液，室温稳定20 min。激光共聚焦显微镜扫描静息状态各组细胞，488 nm氩激光激发Fluo-3/AM发出绿色荧光，观察细胞形态、细胞内Ca2+荧光强度（测60 s，间隔10 s/次）。细胞内Ca2+短暂超载（谷氨酸50 μmol/L作用各组细胞2 min）后，同一视野连续动态扫描（间隔6～10 s），观察各组细胞由钙超载恢复到静息状态的能力。每个图像随机选取10个细胞，用Zeiss LSM Image Browser Version 5.0软件分析其细胞内Ca2+荧光强度并取平均值，结果以图表形式输出，监视器下摄影采集图像。　　1.2.5  谷氨酸转运体1（GLT1） mRNA检测 　　采用RT-PCR技术，结合基因文库，利用Primer 5软件设计GLT1引物：上游5′-CTG-GGG-CCT-GGG-AAG-AAG-AACG-3′，下游5′-CCA-GCG-GGG-AAT-ACC-ACA-3′；β-actin：上游5′-AGC-CAT-GTA-CGT-AGC-CAT-CC-3′，下游5′-GCT-GTG-GTG-GTG-AAG-CTG-TA-3′，扩增片断长度分别为412 bp、222 bp。“异硫氰酸胍-酚-氯仿提取法”分别提取各组细胞的RNA，稀释至1 μg/ml用于cDNA合成。取2 ml cDNA加入MgCl2（50 mmol/L）2 μl、10×RNA PCR缓冲液5 μl、dNTP（10 mmol/L）Mix 1 μl、上下游引物各1 μl、Taq酶0.2 μl 、DEPC处理水37.8 μl，总体积50 μl。PCR梯度扩增仪中95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 min，72℃ 60 s，循环35次；72℃10 min。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶图像处理系统半定量分析，相对表达量以（面积×强度）目的基因/（面积×强度）β-actin表示。　　1.2.6  统计学方法　　数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 11.0软件，组间比较采用F检验。2  结  果　　2.1  各组神经元形态比较 　　神经元体外培养8 d时形成明显神经网络；11 d时D组神经元胞体饱满、边界清晰、折光性强；A组与D组无明显差别；B组神经元胞体肿胀、核固缩、折光性低、突起断裂；C组神经元损伤较B组明显减轻，形态接近正常。　　2.2  各组神经元活性比较 　　见表1。神经元活性A组与D组差异无统计学意义；B组及C组较D组明显降低，但C组明显高于B组（均P<0.001）。表1  各组神经元活性、细胞内Ca2+荧光强度及GLT1 mRNA表达量的比较（略）注：与D组比较*P<0.001；与B组比较△P<0.001　　2.3  各组细胞内Ca2+荧光强度的比较 　　见表1，图1、2。与D组相比，静息状态下A组细胞Ca2+荧光强度无明显改变，B组及C组显著增加（均P<0.001）；但B组较C组增强更明显（P<0.001）。短暂谷氨酸作用后，D组细胞Ca2+荧光强度由145.333±0.814上升到 198.7±6.14，15 min内恢复至静息状态；A组较之上升缓慢但恢复迅速（由 131.533±0.153上升到 170.9±3.43，10 min左右恢复）；B组迅速上升后缓慢恢复（271.367±1.266上升到 350.9±4.98）；C组较之上升稍缓慢，恢复稍迅速（由 200.5±0.10上升到 250.6±2.61），B组及C组15 min内细胞内Ca2+荧光强度始终明显高于静息水平。　　2.4  各组神经细胞GLT1 mRNA表达量的比较 　　见表1、图3。与D组相比，A组GLT1 mRNA表达量明显升高（P<0.001），B组及C组明显降低（均P<0.001）；但C组明显高于B组（P<0.001）。3  讨  论    第三代头孢菌素——头孢曲松钠被广泛应用于临床。研究［2］发现，在电离辐射前1 h应用1 μmol/L头孢曲松钠，可使电离辐射诱导的乳酸脱氢酶（LDH）释放减少87%，DNA破碎减轻；对转基因小鼠肌萎缩侧索硬化模型的研究［3］发现，长期应用头孢曲松钠可以保留小鼠前爪握力，延缓小鼠病程和质量减轻，生存期延长10 d。本实验中，经头孢曲松钠预处理的神经元能明显减轻谷氨酸对其的损伤，不仅细胞的形态无明显改变，而且极显著提高了神经元活性，降低静息状态细胞Ca2+水平，增强短暂神经细胞内钙超载状态下细胞恢复静息状态的能力，增加了细胞GLT1 mRNA的表达量，表明头孢曲松钠能减轻谷氨酸引起的细胞损伤和细胞内钙超载作用，拮抗谷氨酸兴奋性神经毒性，具有神经保护作用。    关于其神经保护作用机制，以往推测头孢曲松钠具有d-α-氨基脂肪酸侧链，可拮抗N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体在氧化损伤时发生神经元的内源性羟基化作用，从而减少神经元氧化损伤［2］。最新研究［4］发现，正常大鼠腹腔注射头孢曲松钠（200 mg/kg）7 d后，海马和脊髓中的GLT1蛋白表达明显增加，可持续3个月。GLT是脑内重要的谷氨酸清除剂，可以将细胞外多余的谷氨酸转运到胶质细胞内，避免兴奋性损伤［5］。本研究结果显示，谷氨酸能下调GLT1 mRNA表达，头孢曲松钠能上调GLT1 mRNA的表达，头孢曲松钠预处理能有效抵抗谷氨酸对GLT1 mRNA表达的下调作用。一系列在体、离体实验［6］表明，胶质细胞膜上的GLT1可能是目前人类已知的最重要GLTs，其在前脑向胞内转运的谷氨酸占全部谷氨酸摄取的90%。所以，头孢曲松钠神经保护作用的机制可能是通过促进GLT1基因转录，使胞外谷氨酸更多地被转运清除。有报道［7］人类GLT1基因启动子区域存在基本转录因子1（Sp1）、N-myc原癌基因和核因子κB （NF-κB）转录因子结合位点，表皮生长因子（EGF）、转换生长因子-α（TGF-α）、血小板源性生长因子可通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）、细胞外信号调节激酶（ERK）、蛋白激酶A （PKA）、蛋白激酶C （PKC）或NF-κB信号途径促进GLT1基因转录，而肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可抑制GLT1基因转录，从而调节GLT1基因的转录率。研究显示，谷氨酸神经毒性中上述一系列因子可发生变化，如TNF-α mRNA水平上调、TGF-α免疫活性降低，产生神经损害作用。而头孢曲松钠也可能是通过调节上述因子来促进GLT1基因转录而产生神经保护作用。    目前尚无通过GLTs途径来拮抗谷氨酸兴奋性毒性的药物研究，更无能够正向调节GLT1的可应用药物。已知用于中枢神经系统疾病治疗时头孢曲松钠在脑膜可达到的浓度为0.3～6 μmol/L［8］;本实验能有效上调GLT1 mRNA表达的头孢曲松钠浓度是1 μmol/L，在其治疗浓度范围内。这就为开发作用于GLT1靶点神经保护药物提供新的思考方向，为开辟这种老药新的临床应用范围提供理论依据。【参考文献】　　［1］Guillet B, Masmejean SLF, Samuel D,et al. Developmental expression and activity of high affinity glutamate transporters in rat cortical primary cultures［J］.Neurochemistry International,2002,40:661.　　［2］Tiina T, Taina U, Mikko T, et al. Tetracycline derivatives and ceftriaxone, a cephalosporin antibiotic, protect neurons against apoptosis induced by ionizing radiation［J］. Neurochem,2001,78:1409.　　［3］Robert H, Brown JD, Phil MD. Amyotrophic lateral sclerosis-A new role for old drugs［J］. New Eng J Med,2005, 31:1376.　　［4］Jeffrey DR, Sarjubhai P, Melissa RR, et al. β-Lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporter expression［J］.Nature,2005,433:73.　　［5］张欣，汤颖，王安宁，等.局部亚低温对大鼠脑缺血后凋亡细胞及谷氨酸转运体、亲代谢型谷氨酸受体表达的影响［J］. 临床神经病学杂志，2007，20：360.　　［6］Shigeri Y, Seal RP, Shimamoto K. Molecular pharmacology of glutamate transporters, EAATs and VGLUTs［J］.Brain Res Rev,2004,45:250.　　［7］Su ZZ, Leszczyniecka M, Kang DC, et al. Insights into glutamate transporter regulation in human astrocytes: cloning of the promoter for excitatory amino acid transporter 2 （EAAT2） ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2003, 100: 1955.　　［8］Nau R. Passage of cefotaxime and ceftriaxone into cerebrospinal fluid of patients with uninflamed meninges［J］. Antimicrob Agents Chemother,1993,37:1518.