宁夏地区脊髓小脑性共济失调家系基因突变特征的研究

作者：杨笑，范学文， 王进， 孔繁元，罗曼，卢燕，史丽娜    作者单位：750004 银川，宁夏医科大学第一附属医院神经内科

【摘要】  目的 研究宁夏地区脊髓小脑性共济失调（SCA）患者基因突变的特征。方法 用聚合酶链反应（PCR）、毛细管凝胶电泳（CGE）及DNA测序方法对1个临床诊断为SCAs的宁夏籍家系中6例SCA患者和4名亲属进行SCA3/MachadoJoseph disease（MJD）基因三核苷酸CAG重复序列检测。结果 此家系中6例患者及1名表型正常的家系成员检测出异常SCA3/MJD等位基因，CAG重复数为66～81次；确诊为SCA3/MJD。其余3名家系成员CAG重复数正常（22～33次）。结论 宁夏地区SCAs患者有SCA3/MJD亚型。提示基因检测对SCAs患者的明确诊断及分型有重要意义。

【关键词】  脊髓小脑性共济失调； 基因突变； 三核苷酸重复；

    Study on gene mutation characteristics of a spinocerebellar ataxias family in Ningxia region  YANG Xiao,Fan Xuewen,WANG Jin，et al.  Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

    Abstract：Objective  To study the gene mutation characteristics of patients with spinocerebellar ataxias(SCA) in Ningxia region. Methods  The SCA3/MachadoJoseph disease（MJD）trinucleotide CAG repeat number was detected by polymerase chain reaction(PCR), capillary gel electrophoresis(CGE) and DNA sequencing  in 6 patients with SCAs and 4 normal kindreds from a family in Ningxia region. Results  All patients and 1 kindred were positive for SCA3/MJD; other 3 kindreds were negative for SCA3/MJD. The CAG repeat number was expanded to 66～81 in the patients with SCA3/MJD and a kindred,and 22～33 in other 3 kindreds.Conclusion  There is SCA3/MJD in the patients with SCAs of Ningxia region. Gene examining has the great significance for definite diagnosis in  the patients with SCAs.

    Key words：spinocerebellar ataxia; gene mutation;ttrinucleotide repeat

　  脊髓小脑性共济失调（SCAs）是以共济失调为主要表现的一大类常染色体显性遗传性神经系统变性疾病。其临床症状纷繁复杂，不同的基因型所表现的临床症状与病理改变存在相当的重叠性，临床分型困难，并且该类疾病多在成年后发病，渐进性和不可逆性加重［1］。近年随着分子生物学研究的突破性进展，已有26种SCA亚型依靠基因诊断明确分型并逐渐取代原有的临床分型［2］。目前国外学者已克隆了SCA1、SCA2、SCA3/MachadoJoseph disease（MJD）、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17和DRPLA 的致病基因［3］，发现均与三核苷酸异常扩增突变相关并归入三核苷酸类疾病。在我国，由于分子遗传学研究相对滞后，SCAs基因分型与诊断尚未全面开展。本研究首次在宁夏地区对1 个临床诊断为SCAs的汉族家系成员进行了SCA3/MJD（此型为SCAs中最常见的类型）基因的检测分析。现报告如下。

    1  对象与方法

    1.1  对象  系2006年在我科就诊的同一汉族家系的6例SCAs患者(SCAs组)及表型正常的4名血缘亲属 (亲属组) 。（1）SCAs组：均为男性；年龄28～77岁，平均46岁；发病年龄21～55岁，平均36岁；病程5～22年，平均10年；符合常染色体显性遗传（图1）；诊断符合Harding标准［4］。（2）亲属组：均为女性；年龄10～52岁，平均30岁；均无异常表现及神经系统异常体征，既往无特殊病史。

    1.2  方法

    1.2.1  DNA提取  抽取SCAs组及亲属组成员外周静脉血4 ml，按经典酚/氯仿方法提取基因组DNA 作为聚合酶链反应（PCR ）模板。

    1.2.2  荧光标记PCR扩增  PCR引物制作: SCA3/MJD引物（加荧光标记）：MJD52 5′CCAGTGACTACTTTGATTCG3′,MJD25 5′TGGCCTTTCACATGGATGTGAA3′ (预定后由上海鼎安生物科技公司制作)。在50 μl PCR 反应体积中,加dNTPs至终浓度400 μmol/L,模板DNA 200 ng,引物各15 pmol/L,Taq酶  

    先证者；■男性患者；●女性患者；□健康男性；○健康女性；／已死亡

    图1  SCAs家系系谱图

    2.5 U,MgCl2终浓度1.5 mmol/L,2×Buffer 25 μl，加去离子三蒸水至总体积50 μl，扩增反应在PE9600PCR反应仪中进行。条件：95℃预变性4 min，然后依次94℃变性40 s,62℃退火50 s，72℃延伸35 s，重复35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶（EB）染色后观察。使用遗传分析仪对所有荧光PCR产物进行毛细管凝胶电泳以获得准确片段长度。

    1.2.3  基因测序及CAG重复数确定  选取2例有异常荧光标记PCR扩增产物患者的样品行普通PCR扩增并用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA后，用DNA测序试剂盒于AB1373自动测序仪上测序。在DNA测序确认为特异扩增基础上，读取荧光PCR扩增产物的长度，然后减去CAG侧翼区的长度再除以3，即为CAG重复数。

    2  结  果

    2.1  荧光标记ＰＣＲ扩增产物检测结果  两组对象的正常PCR扩增片段为一长度229～258 bp的条带。SCAs组及亲属组1名无症状成员除正常条带外，还有一条长度３58～４０2 bp的异常条带。

    2.2  CAG测序结果  2例样品测序结果显示PCR扩增产物是CAG重复序列的特异性扩增。SCAs组6例患者经计算相应SCA3基因内CAG重复数为66～81次，诊断为SCA3/MJD患者；亲属组1人CAG重复数为78次，诊断为症状前患者。PCR扩增产物中正常条带的CAG重复数为22～33次。

    3  讨  论

    SCAs的临床表现复杂，各亚型之间症状交叠，过去依靠临床表现所作的分型随着SCAs分子遗传学研究的进展而被证明有着很大的局限性。近年研究［5-7］证明SCAs各亚型致病基因位于不同的基因位点，基因突变检测成为惟一确切且有效的分类方法（基因分型）。基因内CAG重复序列发生异常扩增是多个SCA亚型的致病原因，因此检测致病基因CAG重复数成为SCAs分型与诊断的重要方法。SCAs发病率为1/10万～5/10万，是危害人类健康的主要神经系统遗传性疾病之一。其常染色体显性遗传的方式、成年发病的特点往往使患者在发病前就已经不可避免的遗传给下一代，而疾病较高的致残率及到目前为止的不可治愈性往往给患者、其家族及整个社会带来很大负担。本家系中因SCAs死亡的有5例，现存的9例SCAs患者中有2例瘫痪，其余7例亦随着病情进展逐渐丧失自理生活能力。在我国，由于分子遗传学研究的滞后，SCAs基因突变研究及其诊断在许多地区还是空白。本研究首次对宁夏地区1个临床诊断为SCA的家系进行了SCA3基因CAG重复数检测，发现6例患者和1例表型正常亲属的SCA3基因突变，CAG重复次数为66～81次；确诊为SCA3/MJD。

    SCA3/MJD最早于17世纪在葡萄牙人中发现，随后在世界各地非葡萄牙裔中陆续发现从而被证明是一种全球性的疾病。SCA3/MJD发病 与SCA1、SCA2、SCA6、SCA7、SCA12、SCA17一样均由CAG三核苷酸重复数的异常增多引起。如SCA3/MJD患者三核苷酸CAG重复数为61～84 次，而正常人为14～37次［8］，正常与致病等位基因重复数存在明显差异。CAG重复数介于47～53 之间的中间类型有少量报道，也显示存在异常临床表型。本例家系所有受检患者及1例表型正常的亲属有SCA3/MJD突变等位基因，而其余正常亲属的CAG 重复数正常，与国内外文献［8,9］报道相符，可明确该家系为SCA3/MJD基因型。本家系的1例症状前患者尚无异常的临床表现，可能与其年龄尚小（15岁）有关，因为SCAs具有成年发病的特点，此家系患者的最小发病年龄是21岁。以三核苷酸CAG重复数异常引起的常染色体显性遗传病可出现遗传早现现象。遗传早现是指患病家系成员中存在下一代较其上一代发病更早且病情更严重的现象。本家系成员中也出现第二代发病年龄提前、病情更重的现象。研究［10］表明遗传早现的分子基础是CAG重复序列的代间不稳定性扩增，下一代的CAG 重复数有比上一代增多的趋势，尤其在父系遗传的情况下更易发生，而发病年龄是与CAG重复数呈负相关，因此在临床上观察到发病年龄逐代提前的现象。如本家系中发病年龄最小的患者其CAG的重复数亦最多。

    本研究表明，通过基因突变分析可以为SCAs患者作出准确的基因分型，为进一步深入研究此类疾病的发病机制和预防、治疗打好基础。临床用基因检测为SCAs家系做症状前及产前诊断从而指导优生优育以逐步减少该病的发病率也是切实可行的方法。

【参考文献】［1］Orr HJ，Chung M，Banfi S.Expansion of an unstable trinucleotide CAG repeat in spinocerebellar ataxia type 1 ［J］.Nature Genet,1993, 4:221.

［2］Yu GY,Michael J.Spinocerebellar ataxia type 26 maps to chromosome 19p13.3 adjacent to SCA6［J］.Ann Neurol，2005，57:349.

［3］Enevoldson TP,Sanders MD,Harding AE.Autosomal dominant cerebellar ataxia with pigmentary macular dystrophy:a clinical and genetic study of eight families［J］.Brain,1994,117:445.

［4］Harding AE.Clinical features and classification of inherited ataxias［J］.Adv Neurol,1993,61:1.

［5］Miguel A,Jodicorral M.Spinocerebellar ataxias in Spanish patients:genetic analysis of familial and sporadic cases［J］. Hum Genet,1999,104:516.

［6］Imbert G,Frederic S.Cloning of the gene for spinocerebellar ataxia 2 reveals a locus with high sensitivity to expended CAG/glutamine repeats［J］.Nat Genet,1996，14:285.

［7］Gisper S,Twells R,Orozco G.Chromosomal assignment of the second locus for autosomal dominant cerebellar ataxia(SCA2) to chromosome 12q2324.1［J］.Nature Genet,1993，4：295.

［8］Maruyama H,Nakamura S,Matsuyama Z.Molecular features of the CAG repeats and clinical manifestation of MachadoJoseph disease［J］.Hum Mol Genet,1995,4:807.

［9］丁新生,程虹,李晨.三核苷酸重复的检测在脊髓小脑型共济失调的应用研究［J］.临床神经病学杂志,1999,12:6.

［10］Maciel P,Gaspar C,Stefano DE. Correlation between CAG repeat length and clinical features in MachadoJoseph disease. ［J］.Am J Genet,1995,57:54.