大鼠孕晚期七氟烷吸入麻醉对子代神经行为和学习记忆功能的影响

　　作者：何莹， 张良成， 郭永正， 林 蕾， 郑晓燕　 作者单位：福建医科大学 附属协和医院麻醉科，福州 350001

　　【摘要】 目的 观察大鼠孕晚期长时间、不同浓度使用七氟烷吸入麻醉对仔鼠神经行为和学习记忆功能的影响。 方法 SD孕鼠15只，随机分为高浓度麻醉(H)组、低浓度麻醉(L)组和对照(C)组，其中H、L组分别于孕第18天吸入4%、2%的七氟烷6 h。出生后仔鼠进行后续实验：P8～P14行悬崖逃避实验，P21和P60行旷场实验，P21～P26(Ⅰ期)和P60～P65(Ⅱ期)行Morris水迷宫实验。 结果 在悬崖逃避实验和旷场实验中，各组仔鼠的神经行为改变差别无统计学意义(P>0.05)。水迷宫实验Ⅰ、Ⅱ期，与C组比较，H、L组平均逃逸潜伏期时间均明显延长(P<0.01)、第三象限活动时间和穿越平台次数均明显减少(Ⅰ期：P<0.01;Ⅱ期：P<0.05)，而L组在定向航行实验和空间探索实验中差别均无统计学意义(P>0.05)。 结论 孕晚期高浓度使用七氟烷麻醉6 h可导致仔鼠学习记忆功能降低，并且持续到成熟期。

　　【关键词】 氟烷;醚类;妊娠，动物;迷宫学习;大鼠，SpragueDawley;神经系统;记忆

　　研究表明，GABAGABAA受体和NMDANMDA受体系统的活性和功能状态对哺乳动物包括人类的脑神经结构和功能的发育具有重要意义。前者活性过度增强或后者功能被明显抑制，均可能导致神经细胞增殖、分化、迁涉、突触生长受抑以及神经细胞凋亡增加，甚至影响神经行为和学习记忆功能的发育[13]，尤其对处于神经细胞增殖分化和突触生长关键时期的大脑影响将更为深远[4]。

　　含氟挥发性吸入麻醉药是临床全身麻醉中使用最为广泛的一类药物，具有增强GABAA受体活性的作用，同时对NMDA受体也有一定的阻滞作用，而且认为此二者作用与其麻醉机制有关。七氟烷是新型的含氟挥发性吸入麻醉药，因其血/气、油/气分配系数低，麻醉诱导、苏醒迅速，近年来在各种手术的全身麻醉中应用逐渐广泛。笔者以2种不同临床麻醉浓度的七氟烷麻醉孕晚期大鼠，观察仔鼠的神经行为和学习记忆功能的变化情况，探讨作为胎儿脑细胞生长发育重要时期之一的孕晚期接触七氟烷，是否将对子代神经功能发育产生不利影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物选择及分组 清洁级SD大鼠15只，孕15 d，体质量380～420 g(上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK沪20032003)。饲养于相同环境3 d，于孕18 d将大鼠随机分为3组：高浓度麻醉(H)组、低浓度麻醉(L)组和对照(C)组，每组5只。

　　1.1.2 七氟烷吸入麻醉 吸入麻醉过程在一自制麻醉箱内进行。自制麻醉箱为有机玻璃材料制成，高、宽、长为25 cm×15 cm×15 cm，用带有3 mm小孔的筛状隔板将箱内空间分割为上(高15 cm)、下(高10 cm)2部，箱顶近中央分别有一大孔和小孔，大孔嵌装的气管导管标准衔接头，可与麻醉机螺纹管紧密连接;箱的两侧面和背面高于隔板2 cm处各有一小孔，每个小孔(包括顶部)分别嵌装一可与多功能气体分析仪自动取样管良好吻合的标准连接头;箱正面有8 cm×18 cm门洞和12 cm×20 cm可左右拉动的门板。实验时，在麻醉箱底部放置适量钠石灰用以吸收CO2，调节麻醉机(ZY9500，无锡中原医疗器械有限公司)氧流量和七氟烷(sevoflurane，批号：8515，日本丸石制药株氏会社)蒸发罐，当通过麻醉箱各侧小孔测定箱内七氟烷浓度达到预定目标：H组4%[约1.8个最低肺泡有效浓度(MAC)]、L组2%(约0.9个MAC)，将孕鼠放置于麻醉箱上部隔板上，6 h后关闭麻醉蒸发罐，待其麻醉自然消退和清醒;对C组孕鼠仅向箱内输送相同浓度的氧气6 h，但不开启七氟烷蒸发罐。接受吸入麻醉的大鼠入睡后，用带状婴儿脉搏血氧饱和度探头环绕于孕鼠腹部，持续监测SpO2(S/5，美国DatexOhmeda公司)。吸入麻醉实验完成后送回原动物房继续饲养，待其自然分娩。预实验中，另设置了高浓度组和对照组2组孕鼠，各8只，在上述条件下实验结束时进行左心室动脉采血行血气分析[5]，结果显示2组PaO2和PaCO2差别均无统计学意义(P>0.05)。

　　1.2 方法 吸入麻醉实验结束时，各大鼠均苏醒良好，继续饲养2～3 d，各组孕鼠分别自然分娩：H组51只、L组56只、C组53只，新生鼠出生后天数以分娩当天记为出生后第0天，此后累加。7 d内每组幼鼠均有出现死亡，H组8只、L组5只、C组6只;成活分别为43、51、47只。从存活仔鼠中，每组分别随机选定8只雄性鼠进行神经行为和学习记忆能力测定。

　　1.2.1 悬崖逃避实验 待出生后第8天(P8)开始，将其放置于30 cm高的平台上，头和两前肢越过平台边缘，60 s内大鼠的头和身体向内侧移动为阳性反应。记录从放置开始到向内移动的时间，若60 s内无阳性反应则记为60 s;一放置到平台就有阳性反应则记为1 s。连续测试7 d(P8～P14)，直至大鼠均能在1 s内呈现阳性反应。

　　1.2.2 旷场实验 于出生后21 d(P21)和60 d(P60)行旷场实验，旷场行为观察箱为长、宽、高分别为80 cm×80 cm×60 cm的无顶木箱，箱底以墨线划分为25个等面积的小方格(16 cm×16 cm)，自中央格放入大鼠，观察120 s内穿越的格子数(3只脚进入其他小方格)、后腿(两前腿同时离地面)直立次数、理毛次数。每完成一只大鼠测试后清理木箱，以免前只大鼠的气味遗留影响实验。

　　1.2.3 Morris水迷宫实验 直径120 cm、高50 cm的水槽，槽壁为均匀黑色，划分为4个象限，每个象限设置入水点标记，于第三象限内设一直径12 cm、高29 cm的透明平台，槽内水深30 cm，使平台没于水下1 cm，水温控制在﹙24±2﹚℃，水池上方安装自动摄像系统。Morris水迷宫实验包括2期，分别于P21(Ⅰ期)和P60(Ⅱ期)进行，内容包括定向航行和空间探索，每期持续6 d，前5 d为定向航行实验：1天4次，将大鼠分别从4个象限入水点面向池壁放入水中，记录60 s内寻找到平台的时间并让大鼠在平台上停留10 s，超过60 s未能找到平台者，用木棒轻柔的将其引上平台并停留在台上10 s，认定其寻找平台时间为60 s，取4次测定结果的平均值为当天的逃逸潜伏期;第6天观察空间探索时移走平台，从第三象限入水将大鼠面向槽壁放入水中，记录60 s内在原平台处穿台次数、第三象限活动时间及活动轨迹图。

　　以上各项实验过程保持室内安静，各物体的摆放、灯光的位置和强度保持不变，实验人员站立的位置也相对固定。实验开始时间均为8∶00，每次实验结束后将大鼠擦干放回笼子，注意保暖，自由饮食。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件处理，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，采用LSD检验进行样本均数两两比较，定向航行实验中组内各天数间比较采用重复测量方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 一般情况 各组孕鼠SpO2均波动于95%～100%。H组与C组、L组与C组比较，各组仔鼠出生死亡率差别均无统计学意义(P>0.05，图1)。

　　2.2 悬崖逃避实验 C组仔鼠悬崖逃避时间于P9、P10稍短于H、L组，但仅显示缩短趋势，未显示统计学意义(P>0.05);3组仔鼠随着年龄的增大逃避潜伏期时间均缩短，并在P14时全部呈阳性反应，各组之间的差别无统计学意义(P>0.05)。表1 仔鼠出生后21 d和60 d行旷场行为实验结果

　　2.4 水迷宫实验 Ⅰ期定向航行实验从出生后第21天持续到第25天，空间探索实验于出生后第26天进行。H组和L组的每天平均逃逸潜伏期均明显比C组长(P<0.01);空间探索实验H组和L组第三象限活动时间明显短于C组(P<0.01)，穿越原平台次数明显比H组少(P<0.01)。Ⅱ期H组各天的平均逃逸潜伏期均明显比C组延长(P<0.01)，L组与C组比较各天的平均逃逸潜伏期差别均无统计学意义(P>0.05);第三象限活动时间及穿越平台次数H组明显少于C组(P<0.05)，而L组与C组比较差别无统计学意义(P>0.05，表2～3)。各组仔鼠空间探索活动轨迹如图2所示。表2 各实验组Ⅰ期和Ⅱ期定向航行实验结果表3 各实验组Ⅰ期和Ⅱ期空间探索实验结果

　　3 讨 论

　　有关脑神经细胞(包括神经元和神经胶质细胞)的增殖分化和突触生长的关键时期，对于不同的种属有所不同，在人类主要是从妊娠6月到出生后2年，而大鼠主要是出生前1～2 d到出生后2周[5]，因此，孕晚期是机体神经细胞结构和功能发育的重要时期。大鼠的怀孕周期为19～22 d，从怀孕第16天始即认为进入孕晚期阶段，本研究是在孕18 d接受七氟烷不同浓度吸入麻醉，分别在第19～21天后娩出子代大鼠，正是在处于脑生长发育的关键时期或临近时期接受吸入麻醉药物。大鼠出生后的一生周期约2～3年，出生后14、21和60 d分别为睁眼期、断乳期和性成熟期，因此实验选择在这3个生长发育转变的时间段进行。结果发现，悬崖逃避实验的逃避潜伏期测定和旷场实验的各种自然行为观察，各组变化之间差别无统计学意义。悬崖逃避实验是观察大鼠通过两侧触须对空间环境位置的感知从而判断其危险性的一种防御反应能力;旷场实验主要是测试动物在新环境中的自主行为、探究行为和紧张度[67]。因此认为，孕晚期大鼠接受临床浓度的七氟烷麻醉，其仔鼠对危险环境的感知与反应以及对新异环境适应和活动行为不产生明显的影响。Morris水迷宫实验是研究空间学习和记忆的一种经典模型[8]，定向航行的逃逸潜伏期可反映获取空间信息的能力，而空间探索实验的行为反映了对在定向航行实验中训练获取信息的记忆储存及再现能力。本研究中，孕晚期大鼠接受2种不同浓度的七氟烷吸入麻醉6 h，仔鼠从出生后第21天开始测定的空间探索逃逸潜伏期明显延长，而在原逃逸平台所处的第三象限的活动时间和穿越原平台位置的次数均明显减少，提示子代大鼠学习空间信息的能力和对获取的信息的记忆功能可能受到影响;出生后第60天进行的测定发现，高浓度组的仔鼠逃逸潜伏期仍延长，第三象限活动时间和穿越原平台位置次数也明显减少，表明孕晚期高浓度七氟烷麻醉对子代的学习和记忆的影响更为深远。七氟烷，包括其它含氟挥发性吸入麻醉药影响生长期的神经细胞的结构和功能发育仍未完全阐明，但已知GABAA受体和NMDA受体活性均参与调节生长期和成年期神经细胞的增殖、分化[1]，调节轴突的生长和生长发育期神经细胞的迁移[2]，甚至影响成年期细胞的存活[3]，而此类药物不但具有增强GABAA受体活性作用，对NMDA受体也有一定的阻滞作用[9]，故推测与此机制有关。而低浓度组仔鼠学习和记忆功能能较早接近对照组水平，表明低浓度麻醉对学习记忆仅在近期有影响，而远期无影响，其确切机制还有待进一步研究。

　　综上所述，本实验结果提示孕晚期大鼠接受长时间、高浓度的七氟烷麻醉可能对仔鼠学习记忆功能降低产生不利影响，并且将持续到成熟期;而低浓度七氟烷麻醉的影响较为短暂。

　　【参考文献】

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