医用臭氧对膝骨关节炎兔关节灌洗液SOD、MDA含量的影响

　　作者：谢 荣， 赵 明， 赵 亮 作者单位：(江苏大学附属医院麻醉科， 江苏 镇江 212001)

　　【摘要】 目的： 探讨医用臭氧对膝关节炎兔关节灌洗液超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的影响。方法： 30只新西兰大白兔随机分为3组：正常对照组(N)、模型对照组(M)、臭氧治疗组(O)，每组10只。M、O组分别于造模第1、4天经右膝关节腔内注射1.6% papain溶液0.3 ml制备骨性关节炎(OA)模型。造模成功后第3、5天向O组动物右膝关节腔内注射20 μg/ml的医用臭氧3 ml。末次注射1周后自右膝关节抽取关节灌洗液测定SOD、MDA的含量。结果： 与N组相比，M组关节灌洗液中SOD的含量降低，MDA的含量升高;与M组相比，O组关节灌洗液中SOD的含量升高，MDA的含量降低。差异均有统计学意义(P<0.05)。结论： 关节腔内注射20 μg/ml的医用臭氧治疗兔膝骨关节炎的机制可能与增强机体清除自由基的能力有关。

　　【关键词】 臭氧; 骨关节炎; 超氧化物歧化酶; 丙二醛

　　Effect of medical ozone on SOD and MDA in the douche fluid of

　　osteoarthritic knee joint in rabbits

　　XIE Rong, ZHAO Ming, ZHAO Liang

　　(Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001, China)

　　[Abstract] Objective: To observe the effect of medical ozone on superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in the douche fluid of osteoarthritic knee joint in rabbits. Method: Thirty adult NewZealand white rabbits were randomly divided into three group: group normal(N)、group model(M)、group ozone (O),each group had ten rabbits. OA modle was produced by injecting 0.3 ml of 1.6% papain solusion into the right knee joint space twice three days apart. 3ml of O3 20 μg/ml was injected into the right knee joint in group ozone on the 3rd and 5th day after OA modal was established successfully. One week later the last injection, douche fluid of the diseased joints were obtained for the measurements of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA). Result: Compared with N group , in M group the activities of SOD in douche fluid of the diseased joints were decreased significantly , the contents of MDA were increased significantly . Compared with M group ,in O group the activities of SOD in douche fluid of the diseased joints were increased significantly, the contents of MDA were decreased significantly. The difference among the groups were statistically significant (P<0.05). Conclusion: The study indicated that ozone 20 μg/ml has beneficial effect on osteoarthritis by improving the ability to clear free radical.

　　[Key words]： ozone; degenerative arthritis; SOD; MDA

　　骨性关节炎(osteoarthritis,OA)，是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。据统计，OA是最常见的老年病之一，患病率和患病人数均居世界首位。近年来，关节腔内注射臭氧治疗膝骨关节炎的报道很多，但其机制还有待于进一步探讨。有研究显示，生物自由基在骨性关节炎的发生发展中起了不可忽视的作用[1]。本研究拟评价医用臭氧对膝骨关节炎兔关节灌洗液中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的影响，以探讨其治疗膝骨关节炎的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验仪器及试剂

　　550 nm分光光度计，37℃恒温水浴锅，台式离心机，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测定试剂盒(由南京建成生物工程研究所提供)，医用臭氧发生器(CHY11B型)。

　　1.2 实验动物及分组

　　健康新西兰大白兔30只，体质量2～2.5 kg，雌雄各半(由江苏大学实验动物中心提供)。动物随机分为3组：正常对照组(N)、模型对照组(M)、臭氧治疗组(O)，每组10只。

　　1.3 方 法

　　1.3.1 动物模型的复制 参照文献[2]的方法建立OA模型，将M、O组实验兔采用戊巴比妥1 ml/kg腹腔注射，右膝关节脱毛，常规消毒，向兔右膝关节腔内注射1.6% papain溶液0.3 ml，于造模第1、4天按以上方法共注射2次。造模成功后第3、5天，O组动物采用戊巴比妥1 ml/kg腹腔注射麻醉，右膝关节常规消毒，用TB针头自骸骨上方刺入膝关节腔。臭氧作为一个强氧化剂，具有潜在的细胞毒性。考虑到本研究对象为小个体动物，故采用了低浓度医用臭氧即用5 ml注射器收集医用臭氧20 μg/ml 3 ml，右膝注射，待实验兔苏醒，观察无异常后，送回兔笼。

　　1.3.2 检测方法 末次注射1周后自右膝关节抽取关节灌洗液，每份关节灌洗液稀释后，分别采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD、采用硫代巴比妥酸法(TBA法)测定分析MDA。

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS11. 5统计软件，数据以均数±标准差(x±s)表示, 多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNKq检验。

　　2 结 果

　　关节液SOD含量：模型组较正常对照组明显降低，差异有显著性统计学意义 (P<0.01);臭氧组较模型组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但仍低于正常组(P<0.05)。关节液MDA含量：模型组较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);臭氧组较模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但仍高于正常组(P<0.05)。表1 关节灌洗液中SOD、MDA活性的变化

　　组别动物只数SOD(U/mgprot)MDA(nmol/L)正常组10127.31±5.052.76±0.92模型组1084.58±4.86a5.46±1.17b治疗组10109.87±7.01b，c3.34±0.76b,c 与正常组比较，a：P<0.01，b：P<0.05;与模型组比较，c：P<0.05.

　　3 讨 论

　　骨性关节炎的发生和发展机制中，生物自由基起了不可忽视的作用，它和细胞因子相互作用，相互促进，推进了病情的演变过程。OA患者关节、滑膜、滑液中常有中性粒细胞聚集，当其表面受到免疫复合物、补体成分等攻击，可释放大量的自由基，如超氧阴离子自由基，很容易形成活泼的羟自由基引起关节软骨退变和关节滑液改变[3]。自由基是含有一个或多个未配对的电子、具有很强反应活性的基团。正常情况下，机体存在氧化系统和抗氧化系统的平衡，细胞内活性氧自由基(ROS)的存在是有益的，它可以防止病原体的入侵，并且ROS水平受体内酶的精细调控。但是在病理情况下，ROS水平的升高可以导致多种退行性疾病(如骨性关节炎)的发生，从而引起机体组织功能的丧失，出现病理状态如关节活动受限和疼痛的产生。

　　国内从上世纪九十年代末引进医用臭氧技术用于椎间盘突出症治疗取得了较为满意的疗效，而应用医用臭氧治疗骨性关节炎国内外均处于探索阶段。万志远等[4]报道了臭氧治疗膝骨关节炎的临床观察，认为取得了较好的临床效果。臭氧通过提高SOD含量，促进清除氧自由基的能力，可减轻氧自由基对关节软骨酶的损伤，中和氧化产物、拮抗炎症介质、减轻膝关节滑膜及周围组织炎症[5]。臭氧又称三原子氧，是氧分子的同素异形体，氧化和氧饱和作用是臭氧生物效应的基础。文献表明，疾病的发生和发展与机体的全身性或局部性缺氧有密切关系:厌氧菌在缺氧的环境下易于繁殖导致感染;某些异常细胞如癌细胞在缺氧的环境下易于增殖导致肿瘤生成。臭氧比氧气的氧化性更强，水溶性更高，更易溶于血液和组织液，因此能够提供更充足的氧化作用和氧饱和作用。

　　本实验应用医用臭氧作用于兔骨性关节炎关节，观察关节灌洗液中SOD、MDA的活性变化，结果显示，20 μg/ml医用臭氧使关节局部SOD含量升高，MDA生成减少，但均达不到正常组水平，差异有统计学意义。本实验结果从一定程度上说明医用臭氧治疗骨性关节炎的机制可能与增强机体清除自由基的能力有关。同时可能还有其他作用存在：一方面，臭氧可减少软骨细胞凋亡，减轻DNA氧化性损伤[6]，维持软骨细胞膜结构和功能的完整性及软骨细胞的正常分裂增殖，促进软骨基质合成，抑制其分解;另一方面，抑制滑膜炎症，减少滑膜炎性物质释放[7]，阻断炎性滑液对软骨细胞、基质及滑膜的侵害，从而达到保护关节软骨，防治膝退行性关节炎的目的。

　　【参考文献】

　　[1] Kim HA, Blanco FJ.Cell death and apoptosis in osteoarthritic cartilage[J]. Curr Drug Targets, 2007,8(2):333-345.

　　[2] 马志坤,傅志俭, 孙 涛,等.医用臭氧对膝骨关节炎兔软骨基质金属蛋白酶1的影响[J].中华麻醉学杂志[J].2007, 27(12):1107-1109.

　　[3] Andreula CF,Simonetti L,De Santis F,et al.Minimally invasive oxygenozone therapy for lumbar disk herniation[J]. AJNR Am J Neuroradiol,2003,24(5): 996-1000.

　　[4] 万志远,韩红军.医用臭氧治疗膝骨性关节炎临床观察[J].中医正骨,2007,19,(12):35-37.

　　[5] 王建华，李靖年.骨关节炎软骨损伤与修复的研究进展[J].中国矫形外科杂志，2006，14(12)：941-944.

　　[6] Bayram H,Sapsford RJ, Abdelaziz MM,et al. Effect of ozone and nitrogen dioxide on the release of proinflammatory mediators from bronchial epithelial cells of nonasthmatic subjects and atopic asthmatic patients in vitro[J].J Allergy Clin Immunol，2001，107(2)：287-294.

　　[7] He XF,Yu ZJ,Teng GJ,et al. Treatment of lumbar disc herniation by using percutaneous intradiscal and paraspinal space injection of O3-O2 mixture[J]. Chin J Radiol(Chinese),2003,37(9):827-830.