七氟醚和缺血预处理对大鼠血清MDA和肝脏组织HSP70表达的影响

　　作者：张厚忠 李红霞 王汉中 作者单位：吉林大学第二医院麻醉科,吉林 长春 130041

　　【摘要】目的 探讨七氟醚预处理和缺血预处理对大鼠血清丙二醛(MDA)和肝脏组织热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法 32只健康的Wistar大鼠,在肝脏缺血再灌注(IR)前,随机分为正常对照组、IR组、缺血预处理组和七氟醚预处理组，用免疫组化染色检测肝组织HSP70的表达并进行图像分析,采用TAB法检测血清MDA。结果 七氟醚预处理组和缺血预处理组HSP70表达均显著高于IR组和正常对照组(P<0.01),IR组的HSP70表达略高于正常对照组,七氟醚预处理组和缺血预处理组间的HSP70表达差异无显著性(P>0.05),而血清MDA水平与HSP70表达呈负相关。结论 七氟醚预处理和缺血预处理均可通过抑制氧自由基的爆发和诱导大鼠肝组织HSP70的高表达而起到保护肝脏免受IR的损伤。

　　【关键词】 七氟醚 缺血再灌注 缺血预处理 丙二醛 热休克蛋白70

　　七氟醚是近年来新型的吸入麻醉药物，具有麻醉诱导迅速、维持平稳、苏醒快速完全等优点，目前关于七氟醚对心肌缺血再灌注(IR)损伤的保护作用研究较多，但对肝脏IR损伤的影响研究较少。本研究观察七氟醚对在体大鼠肝脏IR损伤后血清MDA、肝组织病理学和肝组织HSP70的改变，探讨七氟醚对肝脏IR损伤的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 32只健康Wistar大鼠，雌雄不限，体重250～300 g，购自吉林大学白求恩医学动物实验中心。MDA用比色法测定，试剂盒购自南京建成生物制品公司。HSP70免疫组化染色系统SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司,编号SA2077。

　　1.2 动物模型制备及实验分组 32只健康Wistar大鼠,随机分为正常对照组、缺血再灌注组、缺血预处理组和七氟醚预处理组,每组8只。具体为：IR组:正中剖腹，分离肝十二指肠韧带,暴露肝门部，血管夹阻断门静脉进入肝脏第一次分叉以远，即阻断肝尾状叶及肝左叶血流，造成70%肝脏缺血，阻断90 min，持续再灌注24 h;标本采集:再灌注后24 h取下腔静脉血及缺血部位的 脏组织标本, 取标本后处死大鼠;S组:在持续肝门阻断前，以2 L/min氧流量经七氟醚蒸发罐,蒸发罐开启度为2.5%，含七氟醚气体流经密闭容器,容器出口连接麻醉气体监测仪，测定七氟醚浓度达2.5(1.5 MAC)后，维持10 min进行七氟醚预处理;然后肝门阻断90 min，持续再灌注24 h;IPC组:血管夹阻断肝尾状叶及肝左叶血流，阻断5 min再灌注5 min，共重复2次后阻断肝门，缺血90 min，持续再灌注24 h;C组：未给予任何处置，24 h后取肝组织及下腔静脉血。所有动物术前12 h禁食,自由饮水。

　　1.3 指标的检测 于下腔静脉内取血2 ml，注入试管1 ml，静止沉淀析出血清，常温下离心5 min，(我院检验科BFX5320型低速自动平衡离心机)4 800 r/min，抽出上层血清，并注入离心管内，-20℃冰箱保存。血清MDA用TAB比色法测定,肝组织常规HE染色和HSP70免疫组化染色。

　　1.4 统计学处理 数据以x±s表示，组间比较用方差分析。

　　2 结果

　　2.1 病理学观察

　　2.1.1 大体观 正常对照组大鼠肝脏表面色泽红润,其他组在阻断肝血流后,左叶及中叶肝脏颜色变成暗红色，质地变软。再灌注24 h后,七氟醚预处理组和缺血预处理组大鼠肝脏基本恢复红润,但与正常对照组仍有明显差异，IR组大鼠肝脏表面可见明显的点状或片状的无复流区，呈花白相间花斑状，质地变硬。

　　2.1.2 HE染色光镜观察结果 正常对照组肝细胞、Kupffers细胞及肝窦内皮细胞形态正常;IR组肝细胞核大小不一、有多级核分裂相及染色质边集，可见多数肝窦扩张，周围有大量红细胞淤积，肝窦及毛细血管内有微血栓形成，肝细胞排列紊乱，并呈气球样变性，分布不均匀,甚至在镜下难以看到完整的肝小叶结构;七氟醚预处理组与缺血预处理组肝脏组织形态要明显好于IR组，肝组织结构破坏轻微，仅见部分肝细胞轻度浊肿、偶有变性、坏死及肝窦间隙少量红细胞淤积，肝小叶结构基本完整(图1)。

　　2.2 HSP70指标测定 高倍镜下，细胞浆内呈棕黄色着染者为HSP70蛋白表达阳性细胞，观察切片中10个具有代表性的高倍视野，计算1 000个肝细胞中染色阳性细胞数除以1 000作为HSP70蛋白表达阳性率，并用数码相机成像(图2)。正常对照组HSP70阳性率为0，IR组为(15±2)%，七氟醚预处理组为(39±5)%，缺血预处理组为(36±6)%，IR组阳性率较七氟醚及缺血预处理组均明显减低(均P<0.05)，两预处理组无显著差异。

　　2.3 血清MDA水平 正常对照组〔(1.91±0.147) nmol/ml〕，IR组〔(10.36±1.35) nmol/ml〕较七氟醚预处理组〔(2.54±0.536) nmol/ml〕和缺血预处理组〔(4.18±1.288) nmol/ml〕均明显增高(均P<0.05)，两预处理组无显著差异。

　　图1 I/R组和七氟醚预处理组肝组织(HE，×400)(略)

　　图2 I/R组和七氟醚预处理组HSP70表达(DAB，×400)(略)

　　3 讨论

　　动物实验报道七氟醚可以减少氧自由基(OFR)的产生，具有特殊的心肌保护作用〔1〕，但七氟醚对肝脏IR损伤的保护机制目前并不十分清楚。MDA是OFR与细胞膜中多不饱和脂肪酸发生过氧化反应的产物，MDA的含量可以间接反映OFR的活性;本实验结果显示七氟醚可显著降低肝脏IR损伤后MDA含量，提示七氟醚可减少OFR的产生或清除OFR能力增强，产生抗氧化反应，与Allaouchiche等〔2〕的研究结果一致，说明七氟醚预处理对肝脏有一定的保护作用，可能的机制是七氟醚通过降低钙调节蛋白和钙离子的结合而抑制呼吸爆发产生抗氧化作用〔3〕。

　　七氟醚预处理组和缺血预处理组大鼠的肝组织中HSP70明显增加，而MDA却下降，说明HSP70与MDA在大体上具有负相关性——HSP70的含量高的组MDA数值低。HSP70减轻了肝细胞膜的脂质过氧化反应而实现其保护效应，这一结果与以前的大量相关实验结果〔4〕是一致的。HSP70表达水平与肝细胞的保护作用呈正相关，而HSP70可能是其保作用的物质基础，其可能的机理是七氟醚预处理后，细胞应激蛋白的基因激活，使肝细胞处于抗损的活跃状态，而再次受到缺血再灌注等损害因刺激后，表现出增强的转录和表达活性，最终表现为HSP70的增多。

　　对肝脏IR和各种预处理机制的研究，是目前解决肝脏IR损伤的有效途径，在临床上已显示出良好的应用前景，进一步探讨预处理机制、寻找更有有效的途径，将为临床上对抗肝脏IR损伤提供重要的理论和实践基础。

　　【参考文献】

　　1 Tanaka M, Fujiwara H, Yamasaki K,et al.Superoxide dismutase and N2mercaptopropionyl glycine attenuate infarct size limitation effect of ischaemic/preconditioning in the rabbit 〔J〕.Cardiovasc Res,1994;28 (7):9806.

　　2 Allaouchiche B,Debon R,Goudable J,et al.Oxidative stress status during exposure to propofol,sevoflurane and desflurane〔J〕.Anesthsiol Analg,2001;93:9815.

　　3 Frohlich D,Rothe G,Schwall B,et al.Effects of volatile anaesthetics on human neutrophil oxidative response to the bacterialp eptide FMLP〔J〕.Br J Anaesth,1997;78:71823.

　　4 Liu XH,Shen L,Ke X,et al.A General biological phenomenon and its mechanisms〔J〕.Prog Physiol Sci,1998;29(1):3941.