罗哌卡因硬膜外阻滞对T细胞亚群、NK细胞及免疫球蛋白的影响

　　作者：黄泽清 作者单位：辽宁省肿瘤医院麻醉科，辽宁，沈阳 110042;

　　【摘要】 目的 观察无手术应激情况下罗哌卡因硬膜外阻滞对T细胞亚群、NK(natural killer)细胞及免疫球蛋白的影响。方法 下腹或下肢手术病人45例，硬膜外穿刺后随机分为三组：H组，高浓度 (1%罗哌卡因)组;L组，低浓度 (0.5%罗哌卡因)组;N组，对照组，给以试验剂量和相同容量的生理盐水。应用流式细胞术和免疫扩散法测定阻滞前、阻滞后30min、60min、90min外周静脉血T细胞亚群、NK细胞及免疫球蛋白。结果 与阻滞前比较，H组30min、60min时CD4+ 和(CD3++CD4+)/(CD3++CD8+)值显著升高(P<0.05)，90min差异不显著(P>0.05);H和L组 与阻滞前比较，30、60min时NK细胞显著降低(P<0.05)， 90min时差异不显著(P>0.05);各组免疫球蛋白IgG、IgA、IgM阻滞前后无显著变化(P>0.05)。结论 无手术应激情况下罗哌卡因硬膜外阻滞对细胞免疫功能产生轻微、可逆的抑制作用，对体液免疫功能无影响。

　　【关键词】 罗哌卡因 T细胞亚群 细胞 免疫球蛋白

　　The Effects of Epidural Block with Ropivacaine on T-lymphocyte Subsets, Natural-killer Cell and Immunoglobulin

　　HUANG Ze-qing, WU Nan

　　1.Department of Anesthesiology ,Liaoning Province Tumor Hospital , Shenyang 110042 China;

　　2. Department of Neurology, Liaoning Province Jinqiu Hospital, Shenyang 110016 China

　　【Abstract】 Objective This paper is to observe the effects of epidural blocked with ropivacaine on T-lymphocyte subsets, natural-killer cell and munoglobulin-IgG, IgA, IgM in the condition of no stress of operation. Methods 45 patients requiring epidural anesthesia for inferior belly or lower extremity surgery were randomly divided into three groups: Group H blocked with high concentration local anesthetic (1% ropivacaine) Group L blocked with low concentration local anesthetic (0.5% ropivacaine) and Group N-the control group blocked with only testing dose and identical Saline. Before given testing dose (pre-block) and 30 min, 60 min, 90 min after blocking level stabilized (post-block), venous blood samples were taken from three groups to determinate the T-lymphocyte subsets- CD3+, CD4+, CD8+,(CD3++CD4+)/(CD3++CD8+), natural-killer cell CD+16+56 with flow cytometer and immunoglobulin-IgG, IgA, IgM by immunodiffusion technique. Results Variance of T-lymphocyte subsets: In group H, CD4+ and (CD3++CD4+)/(CD3++CD8+) increased significantly at 30 min, 60 min of post-block (P<0.05) and were not different significantly at 90 min (P>0.05), CD+3 and CD+8 had no significant changes at each time point (P>0.05). The changes of T-lymphocyte subsets in group L and N were no significant contrast to pre-block (P>0.05); Variance of natural-killer cell: Contrast to pre-block, natural killer cell decreased significantly at 30 min and 60 min in group H and L (P<0.05), it had no significant difference at 90 min(P>0.05). Variances at each time point in group N were not significant (P>0.05). The variances between group H and L at each time point were not significant (P>0.05).Variance of immunoglobulin: IgG, IgA, IgM of all three groups had no significant changes at each point of post-block. Conclusions Epidural block with ropivacaine produced sligh, reversible effect on cellular immunity in the condition of no stress of operation, but not on humoral immunity.

　　【Key words】 Ropivacaine; T-lymphocyte subsets; natural-killer cell; immunoglobulin

　　围术期紧张、焦虑、创伤、麻醉等因素可以干扰免疫系统功能，关于不同麻醉方法对减轻手术应激引起的免疫抑制的研究较多，但硬膜外阻滞本身在无手术应激情况下对机体免疫系统的影响未见报道。本研究拟采用流式细胞技术测定硬膜外阻滞后机体T淋巴细胞亚群、NK(natural killer)细胞的变化，采用免疫扩散法测定血清中免疫球蛋白的变化，观察无手术应激情况下罗哌卡因硬膜外阻滞对机体免疫功能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂和仪器

　　1%罗哌卡因(阿斯利康公司)，Simultest IMK-Lymphocyte双色直标的免疫荧光试剂盒(B-D公司)，免疫扩散试剂盒(北京华夏医用检验试剂公司)。FACSCalibur流式细胞仪(美国B-D公司)，太空监护仪(美国)，DYNACⅡCentrifuge离心机(美国B-D公司)， Forma Scientific-86℃深低温冰箱(美国)。

　　1.2 病例选择

　　征得医院相关部门和病人同意后，选择硬膜外麻醉下行下腹或下肢手术病人45例，男25例，女20例，ASA分级Ⅰ～Ⅱ级，年龄14～77岁，体重44～84kg，身高151～190cm。有下列情况之一者被排除：1.既往有内分泌或免疫系统疾病或接受相关治疗;2.硬膜外穿刺失败或给予试验量后有入血、脊麻的症状。随机分为三组：H组，高浓度局麻药(1%罗哌卡因)组;L组，低浓度局麻药(0.5%罗哌卡因)组;N组，对照组，只给以试验剂量和相同容量的生理盐水。

　　1.3 实验方法

　　三组病例于进入手术室前30min肌注咪唑安定50 μg/kg、阿托品10μg/kg。入室后连接监护仪连续监测ECG、HR、BP、SPO2，左侧卧位下选择腰2～3间隙直入法行硬膜外穿刺，成功后放置连续硬膜外导管，仰卧位。诱导前给予试验剂量1%利多卡因5ml，如无入血及脊麻症状则3min后分两次间隔5min给予规定浓度罗哌卡因15ml。每3min用针刺法测定阻滞平面直到痛觉平面稳定。三组病例均于给试验量前，阻滞平面稳定后(对照组取平均值)30、60、90min取外周静脉血各两份：每份1.5ml，EDTA抗凝;一份4ml，3000r/min离心5min后取血清2ml，置于-80℃低温冰箱中保存待测。

　　1.4 指标测量

　　T细胞亚群[CD3+、CD4+、CD8+、(CD3++CD4+)/(CD3++CD8+)及NK细胞(CD+16+56)的测量：用清洁微吸头取EDTA抗凝血100μl小心加入标记好的各装有20μl双色直标免疫荧光试剂(Simultest IMK-Lymphocyte)的试管底部，混合反应30min，然后每个试管再加入1×浓度的溶血剂2ml混匀放置暗处12min(不能超过12min)，加入鞘液洗涤后2500转/min离心10min，去上清后加入0.5ml固定液(1%多聚甲醛)充分混匀2℃～8℃放置暗处待上机测定。

　　免疫球蛋白测定：(1)标准曲线的制备：将标有IgG、IgA、IgM含量的工作标准先用0.5ml蒸馏水溶解，再用生理盐水稀释成五中浓度的标准液，制备IgG、IgA标准曲线取以上各浓度标准液10μl，制备IgM取20μl分别加入各单扩板前五孔测样品，置水平湿盒放37℃恒温培养箱内，48h观察结果，用卡尺测量扩散环的直径，纵轴为Ig含量乘以4，横轴为扩散环的直径，将五点连线即为标准曲线。(2)样品测定：取质控冻干血清加0.4ml生理盐水溶解混匀，测IgG、IgA各取10μl，测IgM取20μl分别注入各自单扩散板孔中，置水平湿盒放37℃恒温培养箱内，48h后用卡尺测量扩散环的直径，即可从标准曲线中查出所对应的Ig的含量。

　　1.5 统计学处理

　　所有用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析及q检验。

　　2 结 果

　　病人一般情况见表1，组间比较无统计学差异(P>0.05)。表1 三组病例一般情况(略)

　　T细胞亚群的变化：与阻滞前比较，H组30min、60min时CD4+ 和(CD3++CD4+)/(CD3++CD8+)值显著升高(P<0.05)，90min差异不显著(P>0.05)，CD3+、CD8+在阻滞前后无显著变化(P>0.05)。L及N组阻滞前后T细胞亚群均无显著变化(P>0.05);NK细胞的变化： 与阻滞前比较，30、60min时，H和L组NK细胞显著降低(P<0.05)， 90min时差异不显著(P>0.05)，N组各时点比较均无显著变化(P>0.05)，H与L组比较，各时点变化差异不显著(P>0.05);免疫球蛋白的变化：阻滞后三组各时点IgG、IgA、IgM均无显著变化(P>0.05)。表2 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+及NK细胞的变化(略)表3 免疫球蛋白含量的变化g/L (略)

　　3 讨 论

　　人体特异性免疫由体液免疫和细胞免疫组成，体液免疫由特异性抗体IgG、IgA、IgM、IgD、IgE介导，主要作用是抑制和中和细菌与病毒;细胞免疫由致敏淋巴细胞介导，它包括不同的T细胞亚群，主要包括CD4+辅助性细胞(Th)、CD8+抑制性细胞(Ts)及细胞毒性T细胞(TL)，而CD3+分子表达于所有外周血成熟T细胞，主要作用包括抑制寄生在细胞内部的病原微生物、对肿瘤细胞的免疫监视及对体液免疫的调节等。它们的含量尤其是(CD3++CD4+)/(CD3++CD8+)的值发生变化可视为免疫调节功能异常;NK细胞是重要的免疫调节细胞，对T细胞、B细胞、骨髓干细胞等均有调节作用，并通过释放淋巴因子对机体免疫机能进行调节，是机体抗感染、抗肿瘤的第一道防线。

　　本研究在无手术应激和输血输液的情况下独立观察罗哌卡因硬膜外阻滞对机体免疫功能的影响，结果显示H组和L组NK细胞呈现一过性的降低， H组CD4+ 和(CD3++CD4+)/(CD3++CD8+)的值一过性升高，这一结果与文献[1]报道一致，提示罗哌卡因硬膜外阻滞产生一过性的免疫功能紊乱。

　　有研究显示利多卡因在体外较高浓度(此浓度远远高于临床麻醉或心律失常治疗时的血药浓度)下对免疫细胞有抑制作用并呈剂量依赖性[2]，但在临床麻醉或心律失常治疗剂量下对机体免疫功能的影响未见报道。硬膜外注射罗哌卡因后总血浆浓度、最大血浆浓度(Cmax)和曲线下面积均随注入剂量成比例上升，而达最大血浆浓度的时间(tmax)保持不变[3,4,5,6]。本实验中采用两种不同浓度的局麻药罗哌卡因，H组应用的罗哌卡因剂量是L组的两倍(分别为1%和0.5%而容量相同)，但结果显示两组对免疫功能的影响轻微且无显著差异，说明本研究所观察到的免疫抑制并非罗哌卡因吸收后对免疫系统直接作用的结果。

　　至于对NK细胞﹑CD4+ 和(CD3++CD4+)/(CD3++CD8+)产生一过性影响的原因，可能是由于硬膜外阻滞破坏了机体自主神经的平衡。有文献报道硬膜外阻滞下行前列腺手术对免疫功能的干扰明显高于臂丛阻滞下行上肢手术的病人[7]。现代的研究还发现，免疫系统不是孤立地存在和行使其功能，而是与神经内分泌系统紧密地联系在一起，某些特定的免疫细胞上同时也有接受神经和内分泌系统调节的分子受体的表达[8,9]。因此，硬膜外阻滞由于改变了自主神经的功能而导致其末梢神经递质释放或性状的改变，必然导致同样是该递质作用靶位的免疫细胞的分布及功能或性状的改变，当然这还是一种推测，有待进一步的研究来证实。

　　本研究观察到免疫球蛋白在阻滞后无明显变化，而文献报道硬膜外阻滞下行前列腺手术病人术中即出现对免疫球蛋白的抑制[8]，正说明了单纯硬膜外阻滞对免疫功能的影响较小。施培青等[10]的研究显示静脉全麻复合硬膜外麻醉较单纯静脉全麻和静脉﹑吸入复合麻醉对免疫球蛋白的抑制轻微，也从侧面证实了这一点。

　　综上所述，罗哌卡因硬膜外阻滞对细胞免疫功能产生轻微、一过性、可逆的抑制作用，对体液免疫功能无明显影响，这种作用与药物浓度和剂量(浓度×容量)无关，交感神经阻滞是其可能的作用基础，但具体的作用机制还有待进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1]Yokoyama M ,Itano Y,et al.The effects of epidural block on the distribution of lymphocyte subsets and natural-killer cell activity in patients with and without pain[J]. Anesth Analg， 2001 ，92(2):463-469.

　　[2]Takagi S, Kitagawa S, Oshimi K, et al. Effect of local anaesthetics on human natural killer cellActivity[J].Clin Exp Immunol， 1983，53(2):477-481.

　　[3]Katz JA,Bridenbaugh PO,Knarr DC,et al.Pharmacodynamics and pharmacokinetics of epidural ropivacaine in humans[J].Anesth Analg ，1990，70:16-21.

　　[4]Emanuelsson BM,Zaric D,Nydahl PA,et al. pharmacokinetics of ropivacaine and bupivacaine during 21 hours of continuous epidural infusion in health male volunteers[J].Anesth Analg ，1995， 81:1163-1168.

　　[5]Erichsen C-J,Sjovall J,Kehlet H,et al. pharmacokinetics and analgesic effect of ropivacaine during continuous epidural infusion for post-operative pain relief[J].Anesthesiology，1996，84:834-842.

　　[6]Concepcion M,Arthur GR,Steele SM,et al.A new local anaesthetic,ropivacaine. Its epidural effects in humans[J]. Anesth Analg， 1990，70:80-85.

　　[7]Gajdosz R . Evaluation of regional analgesia and surgical trauma on selected factors of the human immune system[J]. Folia Med Cracov， 1994，35(1-4):69-86.

　　[8]Blalock JE.The syntax of immune-neuroendocrine communication[J]. Immunol Today，1994，15(11):504-511.

　　[9]Blalock JE, Bost KL. Ligand receptor characteristics of peptides encoded by complementary nucleic acids: implications for a molecular recognition code[J]. Recent Prog Horm Res，1988，44:199-222.

　　[10]施培青，马正美，邱谷，等 . 不同麻醉方法对上腹部手术病人免疫球蛋白的影响[J] . 临床麻醉学杂志，2001，10：546-548.