异氟醚后处理对盲肠结扎穿孔大鼠急性肺损伤的保护作用

　　作者：徐文莉1，何俊1，曾因明1，庞庆丰1，2* 作者单位：(1.江苏省麻醉与镇痛应用技术重点实验室，江苏徐州221002;2.徐州医学院病理生理学教研室，江苏徐州221002)

　　【摘要】 目的 观察异氟醚(isoflurane, ISO)后处理对盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP)后大鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的保护作用。方法 32只SD雄性大鼠随机分为4组(每组n=8)：正常组(N组)，未行任何处理;假手术组(Sham组)，单纯行开腹关腹术;盲肠结扎穿孔术组(CLP组)，行CLP建立大鼠ALI模型;异氟醚组(ISO组)，建立CLP模型后4 h腹腔注射液态异氟醚2 ml/kg。术后12 h各组动物腹主动脉放血处死，右肺进行病理切片和肺湿/干比(W/D)测定，组织匀浆测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)的含量;左肺行支气管肺泡灌洗，取上清液测总蛋白、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)的含量。结果肺组织病理学检测结果显示CLP组大鼠肺组织损伤严重，ISO组肺组织损伤较轻。与N组比较，CLP组和ISO组中SOD含量降低(P<0.01)，其余检测指标均增加(P<0.01)。与CLP组比较，ISO组SOD和IL-10含量较高(P<0.01);其余检测指标均低于CLP组(P<0.05或P<0.01)。结论 在本实验条件下，大鼠腹腔注射液态ISO可发挥抗炎、抗氧化作用，对CLP所致大鼠ALI有部分保护作用。

　　【关键词】 急性肺损伤;肺保护;异氟醚;后处理;盲肠结扎穿孔

　　The protective effect of isoflurane post-treatment on the acute lung injury

　　induced by cecal ligation and puncture in rats

　　XU Wenli1, HE Jun1, ZENG Yinming1, PANG Qingfeng1,2*

　　(1.Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthetic and Analgesic Application Technology, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2.Department of Pathophysiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)

　　Abstract: Objective To investigate the protective effects of isoflurane (ISO) post-treatment on acute lung injury (ALI) induced by cecal ligation and puncture (CLP) in rats. Methods 32 male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups (n=8 each): normal (N) group, with no treatment; Sham-operated control (Sham) group, with mere incision and closure of the abdomen; cecal ligation and puncture (CLP) group, established as rat model of induced ALI; and isoflurane (ISO) group, with intraperitoneal injection of 2 ml/kg ISO 4 h after CLP. The animals were sacrificed by exsanguination via the abdominal aorta 12 h after CLP. The right lungs were removed for pathological dissection; determination of lung wet-to-dry weight ratio (W/D); determination of the content of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and myeloperoxidase (MPO) in the pulmonary homogenate. Following lavages of the left lungs, the supernatant from the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was determined for the total protein level, the content of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-10 (IL-10). Results The pathological results showed that rats in CLP group had serious lung injury, while the rats in ISO group had slight injury. In both CLP and ISO groups, the SOD content decreased (P<0.01) and the other parameters increased (P<0.01), as compared to the N group. The SOD and IL-10 contents were higher in ISO group than in CLP group (P<0.01). The contents of MDA, MPO and TNF-α and W/D were lower in ISO group than in CLP group (P<0.05 or P<0.01). Conclusion In our experiment, intraperitoneal injection of ISO had anti-inflammatory and anti-oxidative effects, which provided partial protection from CLP-induced ALI in rats.

　　Key words: acute lung injury; lung protection; isoflurane; post-treatment; cecal ligation and puncture

　　急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的早期阶段，是临床常见的危重病症。它是损伤因素直接或间接损伤肺毛细血管内皮细胞，导致内皮细胞功能障碍，肺毛细血管通透性增高的血管渗漏综合征[1-2]。其致病因素有多种，其中脓毒症排在首位[3]。目前治疗ALI的方法有病因治疗、体液管理、通气治疗、血液净化等，药物有糖皮质激素、肺泡表面活性物质、一氧化氮(NO)、前列腺素等。但ALI临床治疗效果依然不理想，病死率达40%～60%[4]。因此寻找新的治疗方法和药物极为重要。异氟醚(isoflurane,ISO)具有诱导苏醒迅速、血流动力学平稳等优点，在临床上广泛使用。近年来研究发现，一定剂量的ISO可发挥肺保护作用[5]。ISO预处理可降低脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的幼猪ALI肺泡毛细血管的通透性，而发挥肺保护作用。在大鼠肺缺血/再灌注前，持续给予吸入1最低肺泡有效浓度(MAC)ISO，发现可降低缺血/再灌注损伤导致的血管通透性增加，通过抑制白细胞浸润和肺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA及CD18表达上调，发挥肺保护作用[6]。目前研究多集中在ISO预处理对ALI的保护作用，但ISO预处理不符合临床用药方法，临床意义不大。因此对ISO后处理的研究更有实际意义。本实验从ISO后处理的角度，采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)建立大鼠ALI模型，观察各组病理学、肺血管通透性、肺组织炎症、氧化指标等的改变，观察ISO后处理对大鼠ALI的作用，探讨ISO后处理的肺保护作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物及模型制备 雄性SD大鼠32只，体重200～250 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。采用经典的CLP[7]建立大鼠ALI模型。大鼠术前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉，备皮消毒。于腹正中处切开1 cm切口，进腹找到盲肠，1号丝线结扎1/2盲肠，以20G针头在游离端对穿2次(4个孔)后送回腹腔，缝合切口。皮下注射生理盐水2 ml/100 g，置笼内自由活动，不禁饮食。假手术组开腹后仅提出盲肠，不结扎、不穿孔，其余与CLP组相同。

　　1.2 实验分组及方法 SD大鼠随机分为4组，每组8只：正常组(N组)，不行任何处理;假手术组(Sham组)，单纯行开腹关腹术;CLP组，行CLP建立大鼠ALI模型;异氟醚组(ISO组)，CLP建立模型后4 h腹腔注射液态ISO 2 ml/kg(美国雅培制药有限公司)。各组动物在术后12 h腹主动脉放血处死，右肺进行病理切片和肺湿/干比(W/D)测定，组织匀浆测肺组织中髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量;左肺行支气管肺泡灌洗，取上清液测总蛋白、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 肺组织病理学变化 取右肺下叶置4%甲醛溶液固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，常规切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察病理形态学变化。

　　1.3.2 肺组织W/D的测定 大鼠处死后，立即取右上肺称湿重(W)并记录，而后置于60℃烘箱烘干72 h致恒重，称干重(D)，计算肺组织W/D。

　　1.3.3 肺组织MDA、SOD和MPO测定 取右肺中叶制成10%组织匀浆， 立即离心(4℃，3 000 r/min，10 min)，取上清待用。按MDA、SOD和MPO试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行操作。

　　1.3.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α、IL-10和总蛋白含量测定 大鼠腹主动脉放血处死后，结扎右侧肺门，用4℃生理盐水行左侧支气管肺泡灌洗，每次2.5 ml，缓慢灌洗2次，回收的BALF立即离心(4℃, 1 000 r/min, 10 min)，取上清，按照试剂盒说明书操作，检测TNF-α、IL-10(武汉博士德生物工程有限公司)和总蛋白含量(南京建成生物工程研究所)。

　　1.4 统计学处理 用SPSS 13.0 统计软件进行统计，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 组织病理学改变 N组和Sham组肺泡腔清晰，结构完整，肺泡隔均匀一致，壁光滑，可见少量白细胞，肺泡腔内无渗出液;CLP组肺泡隔明显增厚，大量白细胞渗出、聚集，肺泡腔中可见渗出液和漏出聚集的红细胞，部分肺泡腔萎陷不张;ISO组肺泡隔增厚，部分肺泡萎陷不张，白细胞渗出聚集，肺泡腔内可见漏出的红细胞，但程度均较CLP组轻，见图1。图1 各组大鼠肺组织病理学表现(苏木精-伊红染色，×100)

　　A. N组;B. Sham组;C. CLP组; D. ISO组

　　2.2 各组肺组织W/D比较 Sham组与N组W/D比较差异无统计学意义(P>0.05)，CLP组和ISO组W/D均高于N组(P<0.01)。ISO组W/D低于CLP组(P<0.01)，见表1。

　　2.3 各组肺组织MDA、SOD和MPO含量改变 与N组比较，CLP组和ISO组中SOD含量降低(P<0.01)，MDA和MPO含量增加(P<0.01)。与CLP组比较，ISO组SOD含量较高(P<0.01);MDA和MPO含量均低于CLP组(P<0.05)，见表2。表1 各组大鼠肺组织W/D比较表2 各组大鼠肺组织MDA、SOD和MPO含量的比较与N组比较：**P<0.01;与CLP组比较：#P<0.05，##P<0.01

　　2.4 BALF中TNF-α、IL-10及总蛋白含量改变 CLP组和ISO组TNF-α、IL-10及总蛋白含量均较N组明显增加(P<0.01)。与CLP组比较，ISO组TNF-α含量较低(P<0.01)，IL-10含量较高(P<0.01)。ISO组与CLP组BALF中总蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。表3 各组大鼠BALF中TNF-α、IL-10及总蛋白含量的比较与N组比较：**P<0.01;与CLP组比较：##P<0.01

　　3 讨 论

　　本研究采用经典的CLP致大鼠ALI模型，肺损伤模型容易成功，更接近临床脓毒症导致肺损伤的机体状态。在我们的研究中，CLP术后大鼠出现呼吸急促、皮肤发绀，肺组织光镜观察发现CLP术后肺间质水肿、炎性细胞浸润，肺泡腔内大量红细胞渗出;W/D、BALF中总蛋白含量等均高于N组大鼠，说明CLP致大鼠ALI模型建立成功。

　　在大多数ALI的发病机制中，中性粒细胞(PMN)处于核心地位。目前，多数学者认为许多递质参与肺泡-毛细血管损伤过程，其中PMN的激活是毛细血管内皮细胞通透性增加的主要原因[8-9]。MPO是一种存在于PMN内的酶，肺组织MPO活性与PMN数量相关，可以用来评价PMN在肺组织中的聚集情况。PMN在肺毛细血管中聚集是ALI的最早表现之一[10]。减少PMN的聚集可有效降低肺毛细血管和肺泡受损程度。在肺缺血/再灌注损伤前给予ISO预处理，能通过抑制PMN浸润和肺组织ICAM-1 mRNA及CD18表达上调，对肺损伤起保护作用[6]。本实验发现ISO组MPO含量低于CLP组，提示ISO后处理能减轻PMN的聚集和活性，从而减轻肺损伤程度。肺W/D的高低反映肺组织对蛋白和水通透性的变化。本实验中，CLP组和ISO组W/D均较N组升高，ISO后处理能减低W/D的升高程度，提示ISO后处理能减轻CLP致大鼠ALI肺毛细血管通透性。

　　ISO可通过抗氧化作用对ALI产生部分保护作用。MDA是氧自由基和胞膜脂质过氧化反应的产物，反映机体细胞受活性氧攻击和破坏程度[11]。SOD作为体内清除自由基的一种特异酶，其高低间接反映机体清除氧化代谢产物的能力。本研究中，CLP组和ISO组MDA水平较N组明显升高，SOD水平明显降低，提示各组肺损伤时产生大量的活性氧，发生脂质过氧化反应，肺组织遭受氧化损伤。ISO组的MDA和SOD含量变化程度均低于CLP组，提示ISO后处理可减轻脂质过氧化反应，对CLP致大鼠ALI产生部分保护作用。

　　ALI/ARDS的特征是由肺间质急性炎症反应而导致的肺内皮和上皮细胞屏障损伤，而炎性因子作为重要的信号因子，启动、放大和延续全身或局部的炎症反应。TNF-α是炎症反应中释放最早、最重要的内源性介质，主要来源于单核/巨噬细胞和T淋巴细胞，既可以直接损伤血管内皮细胞、增加其通透性，又可进一步诱导肺泡上皮细胞产生其他的细胞因子和趋化因子。IL-10主要是由Th2细胞产生，抑制免疫应答，导致NO释放增多，属于抗炎细胞因子。它是通过刺激巨噬细胞抑制因子产生复合调节因子，抑制单核/巨噬细胞激活时产生的其他细胞因子，如TNF-α、IL-1β等。本实验中ISO组BALF中TNF-α含量低于CLP组，IL-10含量高于CLP组，提示ISO后处理可通过抗炎作用，对CLP致大鼠ALI发挥部分保护作用。

　　ISO具有诱导苏醒迅速、血流动力学平稳等优点，在临床上广泛应用。但挥发性麻醉药存在不可避免的缺点：需要特殊挥发罐装置，对呼吸道有较强刺激性，遇碱石灰易分解，空气污染等。因此改变吸入性麻醉药给药途径的研究有可能避免上述缺点。目前已有研究证实吸入麻醉药腹腔注射同样有麻醉作用，可以用来研究其作用机制。戴体俊等[12]研究发现，小鼠腹腔注射乙醚、甲氧氟烷、氟烷或安氟醚后均能产生麻醉作用。宋乐等[13]研究发现，大鼠腹腔注射液态ISO同样可以发挥麻醉作用，可用于研究吸入性麻醉药的作用机制。本实验采用的是ISO原液腹腔注射方法，可发挥麻醉作用，亦可避免吸入麻醉药对呼吸道的直接刺激，排除干扰。

　　总之，在本实验条件下，大鼠腹腔注射液态ISO可发挥抗炎、抗氧化作用，对CLP致大鼠ALI有部分保护作用。

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