C纤维在电针口面部穴位镇痛效应中的作用

　　作者：刘健华 符文彬 徐振华 刘雪芳 陈杰斯 作者单位：广东省中医院针灸科 广东省中医院针灸效应规律及机制重点研究室，广东 广州 510120

　　【摘要】 目的 探讨电针口面部四白穴对内脏痛的镇痛作用及传入途径。方法 成年SD大鼠30只，随机分为空白组、内脏痛组、电针+内脏痛组、辣椒素+电针+内脏痛组、溶媒+电针+内脏痛组，每组6只。空白组大鼠腹腔注射生理盐水;内脏痛组大鼠腹腔注射乙酸造成内脏痛模型;电针+内脏痛组先电针双侧四白穴20 min，再腹腔注射乙酸造成内脏痛模型;辣椒素+电针+内脏痛组大鼠首先用辣椒素处理双侧眶下神经，术后5 d待其完全恢复后电针双侧四白穴20 min，再腹腔注射乙酸造成内脏痛模型;溶媒+电针+内脏痛组大鼠用溶媒处理双侧眶下神经，其余处理同辣椒素+电针+内脏痛组。各组大鼠处理完毕后，观察大鼠的行为学变化(扭体反应)以及孤束核(nucleus of the solitary tract，NTS)和三叉旁核(paratrigeminal nucleus，PTN)的cfos表达。结果 (1)电针+内脏痛组腹部收缩次数较内脏痛组明显减少(P<0.01);辣椒素+电针+内脏痛组大鼠腹部收缩次数较电针+内脏痛组明显增加(P<0.05);溶媒+电针+内脏痛组大鼠腹部收缩次数较内脏痛组明显减少(P<0.05)。(2)电针+内脏痛组NTS的cfos表达较内脏痛组明显减少(P<0.05);辣椒素+电针+内脏痛组NTS的cfos表达较电针+内脏痛组明显增加(P<0.01)。(3)电针+内脏痛组PTN的cfos表达较内脏痛组明显增加(P<0.01);辣椒素+电针+内脏痛组PTN的cfos表达较电针+内脏痛减弱(P<0.05);溶媒+电针+内脏痛组PTN的cfos表达较辣椒素组显著增加(26.3±4.50 vs 11.7±2.44，P<0.01)。结论 C纤维在电针口面部穴位对内脏痛的镇痛效应中有重要作用，口面部的躯体感觉传入通过C纤维经PTN中继后与内脏的感觉传入可能在NTS发生汇聚并进行整合，从而产生镇痛作用。

　　【关键词】 四白穴;内脏痛;C纤维;孤束核;三叉旁核

　　Role of C fibers in the analgesia induced by electroacupuncture at Sibai acupoints on visceral pain rats

　　LIU JianHua, FU WenBin,XU ZhenHua,et al.

　　Key Laboratory of Rule and Mechanism on Acupuncture, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong, China

　　【Abstract】 Objective To Role of C fibers in the analgesia induced by electroacupuncture (EA) at Sibai acupoints on visceral pain (VP) rats. Methods Thirty adult SpragueDawley rats were divided randomly into control, VP, EA+VP, Capsaicin+EA+VP and Vehicle+EA+VP groups, 6 rats in each group. Visceral pain was induced by intraperitoneal injection of 0.6% acetic acid and was assessed by counting abdominal contraction. Meanwhile, cfos expression in the nucleus of the solitary tract (NTS) and paratrigeminal nucleus (PTN) was observed by immunohistochemistry. Results Following capsaicin pretreatment (Capsaicin+EA+VP), inhibition of EA at ST2 on abdominal contractions induced by acetic acid was significantly attenuated, indicating difference compared to that in EA+VP group (P<0.05). However, vehicle pretreatment (Vehicle+EA+VP) produced similar effect to acetic acid injection alone. (2) Following capsaicin pretreatment, inhibition of pretreatment of EA at ST2 on acetic acidinduced cfos expression was attenuated. The number of cfos positive neurons in the NTS had no obvious changes compared to that in VP group, and were higher than those in the EA+VP group (P<0.01). Vehicle pretreatment had no effects on the inhibition of pretreatment of EA at ST2 on acetic acidinduced cfos expression, which was higher than that in the acetic acid injection alone (P<0.05). (3) Compared to that in the EA+VP group, cfos expression in the PTN attenuated significantly after capsaicin pretreatment (P<0.05). Vehicle pretreatment had no significant influences on the cfos expression induced by pretreatment of EA at ST2. Conclusions C fibers play an important role in the analgesia of EA at Sibai acupoints on visceral pain, and somatic sensory afferents from orofacial areas and visceral sensory afferents could converge and integrate into the NTS via PTN, which is the basis of the analgesia.

　　【Key words】 Sibai acupoints; Visceral pain; C fibers ;Nucleus of the solitary tract; Paratrigeminal nucleus

　　笔者的前期研究工作表明，电针口面部的四白穴对内脏功能活动具有显著的调节作用〔1，2〕，孤束核(nucleus of the solitary tract，NTS)是其重要的延髓初级中枢〔3〕。在此基础上，进一步研究发现生理状况下C纤维可能是针刺四白穴的感觉传入的主要途径〔4〕。四白穴位于眶下孔，受三叉神经下颌支的分支眶下神经的支配。因此，本研究通过辣椒素选择性损毁眶下神经的C纤维，观察病理状况下电针四白穴对内脏痛大鼠的镇痛效应，探讨电针口面部穴位镇痛作用的传入途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　选用体重180～220 g的成年SD大鼠30只，雌雄不限，由广州中医药大学实验动物中心提供。随机分为空白组、内脏痛组、电针+内脏痛组、辣椒素+电针+内脏痛组、溶媒+电针+内脏痛组，每组6只。空白组大鼠腹腔注射生理盐水;内脏痛组大鼠腹腔注射乙酸造成内脏痛模型;电针+内脏痛组先电针双侧四白穴20 min(疏密波，2～20 Hz，强度以肉眼可见大鼠局部组织颤动为度)，再腹腔注射乙酸造成内脏痛模型;辣椒素+电针+内脏痛组大鼠首先用辣椒素处理双侧眶下神经，术后5 d待其完全恢复后电针双侧四白穴20 min(刺激参数同前)，再腹腔注射乙酸造成内脏痛模型;溶媒+电针+内脏痛组大鼠用溶媒处理双侧眶下神经，其余处理同辣椒素+电针+内脏痛组。

　　1.2 试剂与仪器

　　cfos免疫组化试剂盒(美国Santa Cruz)、SABC免疫组化试剂盒(北京中山生物有限公司)、DAB显色试剂盒(北京中山生物有限公司)。CM1850恒冷箱切片机(德国Leica)，G6805Ⅱ型电针治疗仪(上海医用电子仪器厂)。

　　1.3 穴位定位

　　采用比较解剖学进行大鼠穴位定位。四白穴位于眶下缘眶下孔凹陷处。

　　1.4 造模方法

　　1.4.1 内脏痛模型

　　大鼠清醒状态下腹腔注射0.6% 乙酸(10 ml/kg)造成大鼠内脏痛模型，引起典型的腹部肌肉收缩，同时伴有一侧后肢外伸〔4〕。

　　1.4.2 眶下神经的处理

　　10%乌拉坦(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，手术游离出双侧眶下神经约1 cm，将浸泡在1.5%辣椒素的棉条包绕在眶下神经上。为防治药液浸润周围组织，在其下垫一大小合适的塑料薄膜，20 min后去除棉条和塑料薄膜，缝合切口。溶媒对照组则用浸泡在溶媒(不含辣椒素的20%吐温80的石蜡溶液)中的棉条包绕在眶下神经上，其余处理与辣椒素组相同。

　　1.5 观察指标

　　1.5.1 扭体反应

　　腹腔注射生理盐水或乙酸后观察并记录60 min内大鼠腹部收缩次数。

　　1.5.2 cfos表达

　　各组动物经处理后存活2 h，开胸经升主动脉插管进行灌流。先用0.9%生理盐水100 ml快速冲洗血液，然后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/LPB(pH7.4)400 ml灌注固定50～60 min。灌注完毕后立即取延髓，置于上述灌流液中后固定4～6 h，再移入20%蔗糖PB中过夜(4℃)至组织块沉底。次日取出组织做连续冠状切片，片厚40 μm，切片隔两张取一张，分数套收集于0.01 mol/L PBS(pH7.4) 中。进行免疫组织化学反应。①切片首先入0.03%的H2O2溶液中，室温30 min;②入0.3% TritonX100，室温30 min;③封闭用10%正常羊血清，室温20 min;④多克隆兔抗cfos血清(1∶100，Santa Cruz)，置于湿盒中(4℃)冰箱中过夜;⑤用生物素标记的羊抗兔IgG(工作液，北京中山生物有限公司)，室温1 h;⑥辣根酶标记链酶卵白素复合物SA/HRP(工作液，北京中山生物有限公司)，室温1 h;⑦DAB呈色，室温3～5 min。上述各步骤之间(第三步除外)均用0.01 mol/L(pH7.4) PBS洗涤3次，每次5 min。切片裱于涂有明胶的载玻片上，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。室温晾干后，光镜下观察、计数。空白对照用PBS替代兔抗cfos血清进行上述免疫组织化学反应。替代对照用兔血清稀释液替代兔抗cfos血清进行上述免疫组织化学反应。

　　1.6 统计学方法

　　每只大鼠随机选取 6张切片，光镜下计算每张切片孤束核和三叉旁核cfos阳性神经元的数目。实验数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，全部数据输入计算机用SPSS10.0 for Windows软件进行处理。

　　2 结 果

　　2.1 扭体反应

　　大鼠腹腔注射0.6%的乙酸后，引发典型的内脏痛行为反应(扭体反应)，即腹部肌肉收缩，同时伴有一侧后肢外伸。腹腔注射生理盐水，大鼠不出现扭体反应。电针四白穴预处理后(电针+内脏痛组)，由内脏痛引发的腹部收缩次数明显减少，与内脏痛组比较有显著差异〔(43.2±11.19) vs (88.0±16.66)，P<0.01〕;辣椒素处理双侧眶下神经后(辣椒素+电针+内脏痛组)，大鼠腹部收缩的次数较电针+内脏痛组明显增加〔(80.7±13.28) vs (43.2±11.19)，P<0.05〕，与内脏痛组大鼠相似〔(80.7±13.28) vs (88.0±16.66)，P>0.05〕;溶媒处理眶下神经后，大鼠腹部收缩的次数较内脏痛组明显减少〔(44.3±11.1) vs (88.0±16.66)，P<0.05〕,与电针+内脏痛组相似〔(44.3±11.1) vs (43.2±11.19)，P>0.05〕。

　　2.2 NTS的cfos表达

　　腹腔注射乙酸诱发NTS大量的cfos表达，其阳性神经元主要分布在NTS的内侧亚核、中间内侧亚核以及连合亚核。电针四白穴预处理后(电针+内脏痛组)，内脏痛所致NTS的cfos表达明显减少，与内脏痛组比较有显著差异〔(45.2±5.85) vs (60.4±5.47),P<0.05〕;辣椒素处理双侧眶下神经后(辣椒素+电针+内脏痛组)，NTS的cfos表达较电针+内脏痛组明显增加〔(68.5±10.26) vs (45.2±5.85)，P<0.01〕;溶媒处理后(溶媒+电针+内脏痛组)，NTS的cfos表达与电针+内脏痛组比较无明显变化〔(50.2±7.02) vs (45.2±5.85)，P>0.05〕。见图1。

　　2.3 三叉旁核(paratrigeminal nucleus，PTN)的cfos表达

　　腹腔注射乙酸后，PTN可见少量的cfos阳性神经元;电针四白穴预处理后(电针+内脏痛组)，PTN的cfos表达较内脏痛组明显增加〔(22.3±4.72) vs (6±1.32)，P<0.01〕;电针四白穴预处理后(辣椒素+电针+内脏痛组)，PTN的cfos表达较电针+内脏痛减弱〔(11.7±2.44) vs (22.3±4.72)，P<0.05〕;溶媒处理后(溶媒+电针+内脏痛组)，PTN的cfos表达较辣椒素组显著增加〔(26.3±4.50) vs (11.7±2.44)，P<0.01〕,与电针+内脏痛组比较无明显变化〔(26.3±4.50) vs (22.3±4.72)，P>0.05〕。见图2。

　　3 讨 论

　　迄今为止人们对疼痛的了解大多来自躯体痛而非内脏痛，长期以来一直认为内脏痛只是躯体痛的一种变化而已。因此，针刺镇痛的研究也大多以躯体痛为主。辣椒素局部神经干给药能选择性毁损初级传人C纤维，对有髓纤维影响小，而对运动纤维几乎无影响，是选择性研究传入C纤维的一种非常理想的工具药。不少学者通过辣椒素处理支配穴位局部的传入纤维，对C纤维在针刺镇痛中的作用进行广泛的探讨。刘乡等〔5〕将辣椒素作用于大鼠一侧的腓总神经后，电针足三里对中缝大核神经元伤害性反应的抑制作用明显减弱。辣椒素处理后24 h，电针患侧足三里对痛反应已无明显抑制，但电针对侧足三里仍表现出明显的镇痛效应，表明C纤维在针刺镇痛中起重要作用。朱丽霞等〔6〕在辣椒素处理的新生大鼠身上观察到，针刺远离疼痛部位穴位的镇痛作用明显减弱，针刺疼痛局部的穴位仍有镇痛作用，表明针刺远神经节段穴位的镇痛作用需要C纤维的参与。方宗仁等〔7〕研究发现，辣椒素处理骨神经后电针足三里和三阴交抑制脊髓背角神经元晚成分放电的效应明显减弱。徐嵘等〔8〕也同样用辣椒素处理大鼠坐骨神经，发现电针环跳穴的镇痛效应作用明显。因此，传入C纤维在针刺镇痛中有重要作用。但也有学者对此提出异议。包虹等〔9〕将辣椒素作用于大鼠坐骨神经45 min后，观察到电针足三里和三阴交对脊髓背角广动力神经元的抑制作用无明显影响，因此认为C纤维不是电针镇痛的主要传入纤维，而是弥散伤害抑制性控制(DNIC)的传入纤维。

　　笔者的前期研究表明，辣椒素处理支配四白穴的眶下神经后，电针四白穴诱导三叉神经脊束核尾侧亚核Ⅰ～Ⅱ板层的cfos表达明显减弱〔4〕，提示C纤维可能是四白穴针刺信息的主要传入途径。本研究中，在内脏痛大鼠身上观察到辣椒素处理眶下神经后，电针四白穴的镇痛作用明显减弱。因此，C纤维在电针口面部穴位镇痛效应中发挥重要作用。

　　此外，本研究中还观察到电针四白穴显著抑制内脏痛大鼠NTS的cfos表达，辣椒素处理后此抑制作用也明显减弱，且PTN的cfos表达亦减弱，提示NTS和PTN参与电针四白穴的镇痛作用。

　　NTS接受Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ对脑神经的一般和特殊的内脏传入纤维，是内脏感觉传入的重要中继站。来自内脏的机械、化学等多种伤害性刺激主要通过迷走神经直接上传至NTS〔10，11〕。笔者的前期工作也表明胃扩张和电针口面部穴位均诱导NTS的cfos表达〔12〕，细胞外记录的结果进一步证实NTS存在对口面部的躯体刺激和胃扩张的内脏刺激同时起反应的神经元〔13〕。因此，NTS是内脏感觉传入和面口部穴位的躯体感觉传入汇聚及整合的重要中枢。

　　PTN主要通过包括眶下神经、下牙槽神经、咬肌神经、耳颞神经等接受头面部的躯体传入〔14～16〕。PTN与NTS之间有广泛的传出纤维联系，PTN投射至NTS的纤维终末与直接与接受胃肠等内脏感觉初级传入的终末区在NTS内相互重叠〔17〕。神经束路示踪研究表明，PTN存在着中继三叉神经初级传入并将之向NTS投射的神经元，提示三叉神经和NTS之间存在由二级神经元组成的传入通路〔18〕。因此，口面部的躯体感觉传入通过C纤维经PTN中继后与内脏的感觉传入在NTS发生汇聚并进行整合，这可能是电针四白穴对内脏痛产生镇痛作用的机制。

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