大鼠视上核和室旁核神经元钾离子氯离子共转运体2表达探讨
发表时间：2010-05-28 浏览次数：499次
作者：王德广，张静，陈菲菲，郑殿杰，陈幽婷 作者单位：1.徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，江苏徐州221002;2.徐州医学院解剖学教研室;3.徐州医学院神经生物学教研室
【摘要】 目的 观察神经元特异性标记物钾离子氯离子共转运体2在成年大鼠下丘脑视上核和室旁核的表达。方法 成年SD大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，取脑，冰冻切片，下丘脑部进行钾离子氯离子共转运体2和神经细胞核抗原免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察。结果 钾离子氯离子共转运体2在视上核和室旁核神经元中表达很弱。结论 下丘脑视上核和室旁核部分神经元缺少神经特异性的钾离子氯离子共转运体2表达。
【关键词】 下丘脑;视上核;室旁核;钾离子氯离子共转运体2
基金项目：江苏省教育厅资助课题(06KJD310188)，江苏省麻醉医学研究所开放课题(卫WK200601)
Absence expression of neuronal specific potassium chloride ion cotransporter 2 in supraoptic and paraventricular nuclei
WANG Deguang, ZHANG Jing, CHEN Feifei, ZHENG Dianjie, CHEN Youting
1. Jiangsu Key Laboratory of Anesthesiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;
2. Department of Anatomy, Xuzhou Medical College;
3. Department of Neurobiology, Xuzhou Medical College
Abstract: Objective To observe the neuronal specific expression of potassium chloride ion cotransporter 2 in adult rat supraoptic and paraventricular nuclei. Methods The adult SD rats were sacrificed and fixed with 4% paraformaldehyde to remove the brain for frozen-sectioning. The expression of potassium chloride ion cotransporter 2 and NeuN revealed by immunofluorescence were studied in the photos taken under laser confocal microscope. Results The expression of potassium chloride ion cotransporter 2 was absent from the supraoptic and paraventricular nuclei. Conclusion The neuronal specific potassium chloride ion cotransporter 2 is absent in the supraoptic and paraventricular nuclei.
Key words: hypothalamus; supraoptic nucleus; paraventricular nucleus; potassium chloride ion cotransporter 2
钾离子氯离子共转运体2(potassium chloride ion cotransporter 2，KCC2)是成年哺乳动物脑内神经元特异性表达的膜蛋白[1- 2]，其对成熟神经元胞内的氯离子外排作用是维持成熟神经元胞内低氯离子浓度的重要因素，而神经元胞内低氯离子浓度的维持是抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)离子型受体发挥抑制性作用的前提[3-4]。我们以前的研究表明，成年哺乳动物脑内的缰内侧核缺少KCC2蛋白的表达，同时缺少GABA的A型(GABAA)受体信号系统介导的抑制性作用[5]。
正常脑功能的维持需要保持脑内兴奋性和抑制性神经元活动的稳态平衡[6]，GABAA受体介导的抑制作用是中枢神经系统内主要的抑制性信号系统。下丘脑的视上核和室旁核的神经元既具有神经元的特点，也具有分泌神经递质这一不同于神经元的特点，他们分泌的催产素和加压素对调节生殖器官活动和水电介质平衡等起到重要作用。本研究使用免疫荧光双标并结合激光共聚焦显微镜成像技术检测神经元特异性的KCC2在下丘脑视上核和室旁核中的表达。
1 材料和方法
1.1 实验动物和切片制备
雄性SD大鼠，体重230～250 g(徐州医学院实验动物中心提供)。动物用0.4%戊巴比妥钠麻醉(60 mg/kg)，开胸，经升主动脉向心插管，先灌注100 ml生理盐水，随后以4%冷多聚甲醛(0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制，pH 7.4)灌流固定，取整脑后固定6 h，15%和30%蔗糖溶液各浸泡12 h，30 μm冰冻切片，收取含视上核和室旁核的切片置于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液中(pH 7.4)。
1.2 免疫荧光化学反应
参照文献[5]方法。主要步骤为： 冰冻切片使用5%的正常羊血清室温孵育30 min;第一抗体为兔抗KCC2的多克隆抗体(1∶200，Upstate)和鼠抗NeuN的单克隆抗体(1∶500，Upstate)，4℃孵育48 h;第二抗体为驴抗鼠(FITC标记，Rockson公司，1∶200)或驴抗兔(Cy5标记，Rockson公司，1∶200)的荧光标记二抗，在二抗孵育时加入Nissl红色荧光染料(1∶400，Invitrogen)，室温孵育2 h;PBS洗片，贴片，无色指甲油封片，4℃保存备观察。阴性对照切片使用PBS代替一抗孵育，其他步骤同上。
1.3 激光共聚焦显微镜观察
以阴性对照片确定染色背景，可以观察到NeuN阳性染色为绿色，KCC2阳性染色为蓝色，Nissl阳性染色为红色荧光。
2 结 果
借助Nissl染色(图1-A1、B1)，可以准确确定神经元密集的视上核和室旁核在脑内的位置。在视上核内没有密集的KCC2阳性信号，其阳性表达非常少(图1-B3)，在室旁核内也仅观察到分布较为稀疏的阳性信号(图1-A3)。为证实神经元相关蛋白在该部位的表达缺少，使用神经元的另一标记物——神经细胞核抗原(NeuN)染色得到类似的结果，在Nissl染色细胞密集的视上核和室旁核区域仅有少数NeuN阳性表达(图1-A2、B2)。
3 讨 论
神经内分泌细胞既能接受刺激、传导神经信息，又能分泌激素。它在形态上与通常的神经元相似，有树突、轴突和尼氏体等。神经内分泌细胞产生的神经激素，由轴突末梢释放出来进入血管，通过血液循环运送到靶组织。视上核和室旁核是下丘脑的大神经内分泌细胞密集的部位，其分泌的催产素和加压素可以通过垂体-门静脉系统释放入血发挥调节作用。
KCC2是神经元特异性标记物之一[2, 7]。 本研究中，在神经元密集的视上核和室旁核内KCC2的阳性表达低于周围的脑区，这不大可能是免疫荧光化学染色不均造成的假象，因为染色后所有切片的视上核和室旁核都呈现相同的较弱的阳性信号。因此，KCC2在视上核和室旁核染色弱的原因只能是该部位的神经元着色淡，即该部位神经元缺少KCC2的表达造成。
为确认该部位是否缺乏其他的神经元特异性标记物，作者使用另一神经元标记物NeuN进行观察[8-9]，免疫荧光染色表明在该部位NeuN阳性的神经元明显少于对应的Nissl染色。因此该部位神经元标记物KCC2和NeuN的表达缺乏不是实验假象，应该是神经元特性的真实反映。我们以前的研究表明，小脑的Purkinje神经元也缺少KCC2表达[10]。
本研究结果表明，下丘脑视上核和室旁核神经元虽然具有神经元的一般特点，但缺少部分神经元结构蛋白。部分神经元KCC2的表达缺乏可能是该部位神经元的重要特性之一。KCC2是介导神经元氯离子外排并维持神经元胞内低氯离子浓度的重要因素[4]，而细胞膜内外的氯离子的浓度梯度则是GABA离子型受体赖以发挥抑制性作用的前提[7]。在大鼠脑内，缰内侧核没有KCC2表达，同样缺少离子型GABAA受体介导的抑制性信号系统[5]。视上核和室旁核的部分神经元缺少KCC2表达也表明对于具有内分泌功能的神经元，KCC2依赖的GABAA介导的抑制性突触传递不一定是必须的。
GABAA介导的抑制性作用一般是位相性抑制，即通过突触间的量子式释放作用在突触后膜发挥作用，但在视上核和室旁核GABA介导一种不同的抑制即张力性抑制(tonic inhibition)[11-12]，这可能与KCC2表达的差异有关。
结果提示，KCC2虽然可以作为一般神经元结构的标记物，但在一些脑区，可能出现不同的情况。对这些情况的具体分析不但有助于对特殊部位神经元功能的深入了解，也可更加深入地理解生物多样性。
【参考文献】
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