大鼠血红素加氧酶-1表达对呼吸机相关性肺损伤时SOD、MDA的影响

　　作者：胡伟伟，赵文静 作者单位：(江苏省麻醉与镇痛应用技术实验室，江苏徐州221002)

　　【摘要】 目的 以大鼠呼吸机相关性肺损伤(VILI)为模型，用血晶素(hemin)诱导大鼠血红素加氧酶-1(HO-1)表达，观察VILI时超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性变化及HO-1对SOD和MDA的影响，探讨在VILI过程中的抗氧化应激保护作用及其机制。方法 32只雄性SD大鼠随机分成4组(每组n=8)：对照组只做气管切开术，保留自主呼吸;模型组气管切开后行机械通气4 h;诱导剂组于模型制备前24 h腹腔注射血晶素40 μmol/kg;抑制剂组于模型制备前24 h腹腔注射锌原卟啉(ZnPP)10 μmol/kg。机械通气4 h后处死大鼠，收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)标本，测定BALF中总蛋白含量，肺组织湿/干重比值(W/D)，肺组织LDH、SOD活性和MDA含量，检测肺组织HO-1蛋白表达，光镜下行肺组织病理学观察。结果 与对照组相比，模型组大鼠肺组织病理损伤严重，肺W/D、BALF中总蛋白、LDH活性均明显增加，VILI模型复制成功。与模型组比较，诱导剂组肺组织HO-1表达增加，肺组织病理损伤明显减轻，SOD活性明显增加而MDA含量明显下降，用ZnPP抑制HO-1表达，此种保护作用消失。结论 血晶素诱导大鼠HO-1表达可以增加SOD活性，降低MDA含量，减轻肺的氧化应激损伤，降低VILI的程度。

　　【关键词】 呼吸机相关性肺损伤;血红素加氧酶-1;超氧化物歧化酶;丙二醛

　　The effect of HO-1 expression on SOD and MDA in ventilator-induced

　　lung injury in rats

　　HU Weiwei, ZHAO Wenjing*

　　(Jiangsu Province Key Laboratory of Applied Technology for Anesthesia and Analgesia, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To observe the variations in superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) levels in ventilator-induced lung injury (VILI) and the effects of HO-1 expression on SOD and MDA with the establishment of rat model of VILI and the induction of heme oxygenase-1 expression by hemin, and to investigate the protective effect and the underlying mechanism of anti-oxidative stress in VILI. Methods 32 male Sprague-Dawley rats were randomized into 4 groups: control group (tracheotomy only, with spontaneous breathing retained), model group (tracheotomy followed by 4 h of mechanical ventilation), inducer group (intraperitoneal injection of hemin 40 μmol/kg 24 h before model establishment), suppressor group (intraperitoneal injection of ZnPP 10 μmol/kg 24 h before model establishment). 4 h after mechanical ventilation, the rats were sacrificed and the lung tissue and samples of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were collected for determination of total protein in BALF, wet-to-dry weight ratio (W/D) of lungs, LDH assaying and the activity of SOD and MDA of lung tissue, detection of lung tissue HO-1 protein expression, and observation of histopathological changes of lungs by light microscopy. Results Compared with the control group, rats in the model group had serious lung histopathological injury and marked increase in W/D of lungs, total protein in BALF and LDH activity, respectively, which suggested the successful establishment of VILI model. In the inducer group, as compared to the model group, HO-1 expression level increased and the lung histopathological injury was significantly attenuated, SOD activity significantly increased while MDA content significantly decreased. With the inhibition of HO-1 expression by ZnPP, this protective effect was reversed. Conclusion Hemin-induced HO-1 expression can increase SOD activity, decrease MDA content, alleviate oxidative stress injury to lung tissues and reduce the extent of VILI.

　　Key words: ventilator-induced lung injury; heme oxygenase-1; superoxide dismutase; malondialdehyde

　　血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血红素催化降解的限速酶，可在NADPH 和细胞色素P-450还原酶及分子氧作用下，催化血红素降解为胆绿素、CO和铁。迄今为止,已发现3种HO的同工酶：HO-1、HO-2、HO-3,分别由不同基因所编码。其中HO-1是生物体内最易被诱导的抗氧化酶类，具有很强的抗氧化应激效应，其本身及代谢产物均具有调节抗氧化酶、拮抗氧化损伤等功能[1]。研究表明，急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)时，机体氧化/抗氧化平衡失常，机体处于氧化应激状态，HO-1在肺内被应激刺激稳定表达 ,对于维持氧化损伤时机体自身稳定起了重要作用。但HO-1对呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury ,VILI)是否具有保护作用研究较少。本研究以大鼠VILI为模型，用血晶素(hemin)诱导大鼠HO-1表达，观察VILI时超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量变化及HO-1对SOD和MDA的影响，探讨HO-1对VILI的抗氧化应激作用及机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试剂与仪器 HO-1诱导剂血晶素和HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP)购自Sigma公司;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;HO-1多克隆抗体、SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;其他试剂均为国产分析纯。DH-150型小动物呼吸机购自浙江大学医学仪器厂。

　　1.1.2 实验动物 清洁级雄性SD大鼠，体重250～300 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组 32只大鼠随机分为4组，每组8只。①对照组(C组)：只做气管切开术，保留自主呼吸。②模型组(M组)：气管切开后行机械通气4 h，呼吸机参数设置：潮气量(VT)30 ml/kg;呼吸频率(RR)40次/min ;吸呼比(I∶E)=1∶3;吸入氧浓度(FiO2 )21%。③诱导剂组(H组)：模型制备前24 h腹腔注射血晶素40 μmol/kg。④抑制剂组(Z组)：模型制备前24 h腹腔注射ZnPP 10 μmol/kg。

　　1.2.2 VILI模型 大鼠术前禁食12 h，自由饮水，称重后10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔内注射麻醉。仰卧位固定，常规消毒后行气管切开并插入自制气管导管，接小动物呼吸机开始机械通气。呼吸机参数设置：VT 30 ml/kg;RR 40次/min;I∶E=1∶3;FiO2 21%，通气时间4 h。

　　1.2.3 标本采集 通气4 h后，腹主动脉放血处死大鼠，迅速开胸结扎右侧肺门。以4℃生理盐水行左支气管肺泡灌洗,每次灌洗量为2 ml,共灌洗3次，回收率>85%。收集支气管肺泡灌洗液(BALF),3 000 r/min离心10 min,取上清液-70℃保存。取右肺上叶组织,10%甲醛固定 24 h ,梯度乙醇脱水 ,二甲苯透明,石蜡包埋，用作病理学检查及免疫组化检测。取右肺中叶100 mg(湿重),加入4℃生理盐水1 ml,冰浴下制成10%的肺组织匀浆,4℃，3 000 r/min离心10 min,取上清液-70℃保存。

　　1.2.4 检测指标及方法

　　1.2.4.1 病理学观察 苏木精-伊红染色,光镜下对比观察肺组织病理学特征性变化及程度。

　　1.2.4.2 BALF中总蛋白含量 取BALF上清液，采用考马斯亮蓝染色法,通过测定样本光密度计算蛋白含量。所有操作均严格按照试剂盒说明进行。

　　1.2.4.3 肺W/D测定 取右肺下叶,称湿重后置80℃恒温箱烘烤至肺干重恒定,称干重,计算肺湿/干重比值(W/D)。

　　1.2.4.4 LDH测定 取肺组织匀浆上清液，通过比色法求出酶活力。所有操作均严格按照试剂盒说明进行。

　　1.2.4.5 肺组织MDA和SOD测定 取肺组织匀浆上清液，分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法，所有操作均严格按照试剂盒说明进行。

　　1.2.4.6 HO-1蛋白表达检测 石蜡包埋切片以4 μm 厚切片,分别按免疫组化SABC法，DAB显色,封片镜检,棕黄色颗粒为阳性产物。采用Image-Pro Plus 6.0 高清晰度彩色病理图像分析系统进行处理，每标本随机选取5个不重叠的视野,测定免疫组化反应阳性颗粒的平均光密度值(D值),并计算5个视野D值的均值,半定量分析HO-1蛋白表达。

　　1.3 统计学处理 以SPSS 13.0统计学软件包进行统计学处理。计量资料以±s表示。组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 病理学改变 C组肺无明显病理学改变，肺组织结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见出血、水肿，肺泡间隔正常。M组肺组织病理学改变明显，肺组织结构破环严重，肺泡壁增厚，肺泡腔内可见大量红细胞，肺泡间隔明显增厚，大量炎症细胞聚集。与M组比较， H组肺组织病理学改变明显减轻，肺泡间隔一定程度增厚，炎症细胞减少，肺泡腔内未见明显出血及水肿。Z组与M组比较未见明显改变。见图1。

　　图1 各组肺组织病理学变化(苏木精-伊红染色，×400)

　　A. C组;B. M组;C. H组;D. Z组

　　2.2 肺W/D、BALF中总蛋白含量和肺组织匀浆LDH含量变化 与C组比较，M组W/D、BALF总蛋白含量和LDH含量明显升高(P<0.01)。与M组比较，H组W/D及BALF总蛋白含量均降低(P<0.05)。与M组比较，H组LDH含量虽降低，但差异无显著性(P>0.05);抑制剂Z组与M组比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

　　2.3 肺组织匀浆SOD活性和MDA含量变化 与C组比较，M组SOD活性明显降低(P<0.01)。与M组比较，H组SOD含量升高(P<0.05);抑制剂Z组与M组比较差异无显著性(P>0.05)。与C组比较，M组MDA含量明显升高(P<0.01)。与M组比较，H组MDA含量降低(P<0.05);抑制剂Z组MDA含量与M组比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。表1 各组肺W/D、BALF总蛋白、MDA、SOD、LDH含量变化与C组比较：**P<0.01;与M组比较：#P<0.05

　　2.4 肺组织中HO-1的表达 C组肺组织中偶见棕黄色颗粒表达;M组肺泡巨噬细胞及肺间质浸润的炎性细胞胞质均可见微弱阳性颗粒表达;H组HO-1棕黄色颗粒呈阳性表达，而Z组阳性表达极低。见图2。免疫组化半定量结果显示，M组HO-1阳性表达大于C组，H组HO-1阳性表达大于M组(P<0.05);而Z组与C组比较HO-1阳性表达差异无显著性(P>0.05)。见表2。

　　3 讨 论

　　目前，呼吸机的应用已成为抢救危重病患者最重要的仪器设备之一，但机械通气本身却可以引起或加重肺损伤，即VILI。本实验设计是参考武庆平等[2]大鼠大潮气量机械通气致肺损伤实验模型，模拟临床上ALI/ARDS患者需要大潮气量机械通气以及此类患者可能会发生“婴儿肺”[3] ,即采用小潮气量通气，但由于局部肺不张等原因在肺其他部位也会产生像大潮气量通气引起的肺损伤。肺W/D、BALF中总蛋白含量可反映肺水肿的程度，肺组织匀浆上清中LDH的活性可反映肺组织细胞的损伤程度。本研究结果显示，与C组相比，M组大鼠肺组织病理损伤严重，肺W/D、 BALF中总蛋白含量、LDH活性均较C组明显增加， VILI模型复制成功。

　　本实验选择血晶素作为HO的诱导剂，因血晶素既是HO的底物，同时又是HO的促进剂，能增强HO的活性。结果显示，血晶素可以诱导肺组织HO-1的表达，降低肺组织水肿程度，减轻肺组织病理损伤，对肺组织发挥一定保护作用，而给予HO-1抑制剂ZnPP后，此种保护作用消失，说明HO-1直接参与了对VILI的保护作用。

　　MDA和SOD可准确地评定肺内的氧化-抗氧化状态。MDA含量增加和SOD活性降低表明其脂质过氧化程度增加，组织损伤加重，反之则说明组织得到保护。本研究结果显示，与M组比较，H组MDA下降而SOD活性增加，呼吸机所致肺损伤程度明显减轻，而给予HO-1的抑制剂ZnPP后,这些保护作用消失，提示HO-1可以减轻肺内氧化应激和氧化损伤，增强机体的抗氧化能力。石缨等[4]也发现HO-1过表达可通过提高SOD活性和降低MDA含量以增强肺组织抵抗氧化应激损伤的能力，降低犬肺移植后的损伤。

　　研究表明VILI本质上是一种生物伤[5]，致病机制之一可能是由于过度的机械刺激引起肺细胞内氧化应激，导致氧化-抗氧化系统失衡;从而激活多种和炎症密切相关的信号转导通路,使各种致炎因子和氧化物质表达增多[6-7],抗氧化物质减少，引起炎性细胞在肺组织“募集”,从而造成肺损伤[8]。而HO-1能直接上调抗氧化酶的产生，直接增强机体的抗氧化能力[9]，对抗VILI导致的氧化应激损伤。ZnPP抑制HO-1的表达及活性，一方面使体内血红素蓄积，氧自由基生成增多，另一方面又减少具有抗氧化作用产物的生成，降低HO-1的抗氧化酶活性，必将加重肺损伤[10-11]。

　　本实验证实，VILI可以引起肺组织内氧化应激损伤， 血晶素可以诱导大鼠HO-1表达，通过增加SOD活性，降低MDA含量发挥机体抗氧化应激效应，对VILI起到一定保护作用。

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