培养不同时间大鼠皮质在缺糖缺氧损伤中神经元凋亡的观察

　　作者：于常州 刘功俭 作者单位：徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，江苏徐州221002

　　【摘要】 目的 观察培养不同时间的大鼠脑皮质神经元对缺糖缺氧的敏感程度, 探讨培养时间在皮质神经元损伤中的作用。方法 首先分离孕18天胎鼠的皮质神经元，分为对照组和实验组。实验组于培养6天、8天、12天时分别进行缺糖缺氧(OGD)2 h，然后培养24 h;采用DAPI染色﹐荧光显微镜下观察细胞的形态变化。对照组除不进行OGD的损伤外，其他条件与实验组一致。结果 培养12天较培养8天的皮质神经元细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.05);培养6天的皮质神经元的细胞凋亡率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 不同培养时间的皮质神经元对OGD损伤反应不同;未成熟的皮质神经元对OGD不敏感,具有耐受性;成熟的皮质神经元随成熟程度的增加，对OGD敏感性增强。

　　【关键词】 皮质神经元 缺糖缺氧 凋亡 大鼠

　　The influence of culture time on apoptosis of rat cortical neurons induced

　　by oxygen and glucose deprivation

　　YU Changzhou， LIU Gongjian

　　(Jiangsu Provincial Key Laboary of Anesthesiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract：Objective To investigate the effect of culture time on the apoptosis of fetal rat cortical neurons induced by oxygen and glucose deprivation (OGD).Methods The cortical neurons separated form 18-day fetus rat were cultured for 6 days, 8 days and 12 days to get immature, grown and aged neurons respectively. OGD, only in the test groups, was induced by oxygen deprivation for 2 hours after the culture medium was displaced with glucose free medium to continue the culture for 24 hours. The apoptosis was then evaluated after DAPI staining method was used to illustrate the neuronal changes. Results The elevated rate of neuronal apoptosis was higher in the 12-day group than in the 8-day group (P<0.05). No significant differences in apoptosis response to OGD insult were found between the 6-day cultures, with and without OGD (P>0.05).Conclusion The reaction to OGD insult varies with the maturity of the cultured cortical neurons. The immature neurons are insensitive and tolerant to lack of oxygen, and the sensitivity increases with the age of neurons.

　　Key words： cortical neuron; oxygen and glucose deprivation (OGD); apoptosis; rat

　　哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system, CNS) 损伤修复参与的因子比较多，其中凋亡是CNS损伤修复过程中一个重要的手段。不同发育期的细胞，其凋亡的情况也不同。初步的研究结果提示，成熟的细胞或衰老的细胞对损伤反应更敏感，容易凋亡，从而保护机体健康的细胞;而未成熟的细胞或活力强的细胞则可能对损伤有一定的耐受性。皮质神经元对学习、记忆有很重要的作用，其受损伤后经常会表现痴呆和记忆丧失，这在缺血性脑卒中和老年痴呆症患者中表现最为明显。随着中国甚至世界社会老龄化的到来，老年病的研究将势在必行。关于不同年龄段的皮质神经元对缺糖缺氧(oxygen and glucose deprivation, OGD)损伤的研究，国内外少见研究报道。本实验研究通过特殊的培养基体外培养大鼠脑皮质神经元，在培养的不同时间段(即体外模拟不同年龄段的皮质神经元)制作细胞OGD损伤模型,模拟在体的“缺氧缺血”状态，观察不同时间段的皮质神经元对OGD的反应。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 孕18天Sprague-Dawley(SD)大鼠, 由徐州医学院实验动物中心提供。

　　1.1.2 主要试剂 高糖DMEM干粉培养基、无血清神经元基础培养基、B-27添加剂为美国Gibco BRL公司产品，DMEM/F12为美国Hyclone公司产品，胎牛血清、马血清由中国医学科学院血液研究所提供，胰酶为美国Difco公司产品，谷氨酰胺由上海实生细胞生物技术公司提供，甘氨酸、D-多聚赖氨酸、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidine-2-phenylindole, DAPI)、联苯二胺为美国Sigma公司产品，其余试剂为国产分析纯。

　　1.2 方法 采用分组对比的方法，将培养的皮质神经元分为对照组和实验组进行研究观察。具体方法如下。

　　1.2.1 皮质神经元的体外培养 按参考文献[1-3]方法并略作改进。孕18天SD大鼠断头处死，迅速取出胚胎置于冰冷的h-DMEM溶液中，逐一断取胎头，体视镜下逐层剥除皮肤、颅骨、脑膜及表面血管，暴露双侧大脑半球，取浅层新皮质剪碎至0.5～1.0 mm3大小。将所得皮质置于含0.25%胰酶及68 mmol/L EDTA的Hank′s平衡盐溶液中，37℃消化15 min，吸弃上层溶液并加含10%胎牛血清和10%马血清的高糖DMEM溶液轻轻吹打，200目滤网过滤，800 g离心5 min后，用上述含血清的高糖DMEM溶液悬浮细胞，以4×108/L的细胞密度接种于预处理的培养瓶或24孔培养板中(内置1 cm×1 cm的盖玻片);预处理采用含有25 g/L 左旋多聚赖氨酸的152 mmol/L H3BO3-NaOH缓冲溶液，pH 8.4，覆盖室温过夜，置于37℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养，第4～6 h将培养基换为常规培养液〔神经元基础培养基与DMEM/F12混合培养基(体积比为3∶7)，含1% B-27添加剂、5%胎牛血清及0.5%谷氨酰胺〕，3～4天半换液1次。

　　1.2.2 皮质神经元的OGD模型制备 选取实验组3个不同培养时间的皮质神经元,即未成熟的皮质神经元(培养6天)、成熟的皮质神经元(培养8天)、衰老的皮质神经元(培养12天),采用无糖培养基和连续向CO2培养箱中通高纯氮气制作OGD模型:不同培养时间的皮质神经元细胞，首先弃去培养液，用无糖培养液洗涤细胞2次，然后置于通入高纯氮气的CO2培养箱中，连续通气2 h，之后换上正常的培养基，培养24 h后，DAPI染色观察。对照组不经过OGD处理。

　　1.2.3 DAPI荧光染色 分别将培养不同时间经OGD后又培养24 h的实验组和相应时点的对照组的皮质神经元，用PBS溶液轻洗2次，4%多聚甲醛(溶于0.1 mol/L PB，pH 7.4)室温固定15 min后， 再次用PBS溶液轻洗2次，加入10 mg/L DAPI(用含0.2% Triton的PBS溶解)，37℃孵育30 min。在Olympus荧光显微镜上，以400 nm为激发光，455 nm发射光观察。

　　细胞发生凋亡的判定方法为：细胞的胞核边缘不规则，细胞核染色体浓集，着色较重，并伴有细胞核固缩和细胞核碎片增加现象。凋亡率(AI)的计算方法为：400倍下每孔中随机选取10个视野，计算视野中凋亡细胞占总细胞数的百分率，求均值。

　　1.3 统计学处理 每组4个样本，分别来自于4批独立培养的细胞。所有实验数据以±s表示;统计方法采用方差分析(ANOVA)，多个实验组与一个对照组的比较采用LSD法(least significant difference)，各实验组间的两两比较采用q检验(Newman-Keulstest); P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 培养不同时间神经元生长状态 倒置相差显微镜下观察。接种30 min后神经元基本贴壁，多呈圆形，个别细胞开始伸出突起;24 h胞体形态开始分化，有锥体状、卵圆状等，有较强折光性和立体感，突起分支细长，而且开始有成簇聚集倾向;第5天胞体渐增大，突起伸长并交织成网;第8天细胞呈簇状分布，突起丰富，粗而长，相互交织成网状;第18天的神经细胞数量减少。相对于对照组的皮质神经元,经OGD后的皮质神经元细胞有轻微的脱壁现象,少数细胞完整性遭到破坏,折光性降低,立体感遭到破坏,有些突起消失;随着培养时间的增加，培养12天的皮质神经元细胞形态变化最为明显，培养8天者次之，培养6天者只有轻微变化。

　　2.2 培养不同时间皮质神经元细胞OGD后的凋亡率 未成熟皮质神经元细胞(培养6天)OGD后的凋亡率与未经OGD的培养相同时间的皮质神经元细胞凋亡率比较,没有统计学意义(P>0.05);而培养8天和12天的经OGD的皮质神经元与培养相同时间的未经OGD的皮质神经元相比对,凋亡率明显升高(P<0.05);而培养12天经OGD的凋亡率比培养8天经OGD的凋亡率增高。见图1、表1。表1 2组皮质神经元凋亡率比较 与对照组比较：*P<0.05;与实验组培养8天比较：#P<0.05

　　3 讨 论

　　凋亡是一种主动的细胞死亡方式，与细胞坏死相比在细胞的形态变化和发生的分子机制上存在着显著的差别。典型的凋亡细胞表现为渐进性发生的胞体及胞核的浓缩，在凋亡的过程中(早中期)始终保持包膜及细胞器膜结构和功能的完整性，具有规则而且特异的DNA降解方式，在体条件下为单核巨噬细胞所吞噬;与此相比，坏死细胞则迅速发生胞体、胞核及细胞器的肿胀及膜完整性的丧失，同时DNA以不规则断裂的方式降解[4]。本研究采用DAPI染色方法，从细胞的形态、功能方面对OGD模型中的细胞死亡方式进行检测、鉴定。尤其是采用与染色质结合的荧光染料DAPI，可以直接观察到核的变化，从而识别细胞凋亡。而TUNEL染色通过检测凋亡细胞中核酸内切酶激活而裂解DNA链后暴露的3′-OH端，从生化机制上识别凋亡。本实验发现：在培养不同时间内，部分细胞渐进性地出现一些凋亡的特征性改变，如胞核DAPI染色、胞质的浓缩;应用DAPI染色与本实验室前期TUNEL染色方法所检测到的凋亡阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。此现象提示：急性过氧化氢刺激可诱导皮质神经元发生凋亡。

　　在实验中我们还发现，上述模型中的细胞凋亡改变有一个显著特点，即：胞核的浓缩进程明显快于胞质，核质比例明显变大。

　　有研究提示神经元对刺激因素的敏感性与离体培养时间有关系[5-6]，本实验结果表明：培养早期的神经元对OGD刺激不敏感，而培养8天以上的神经元之间不仅已建立起丰富的突起连接，而且对OGD的敏感性趋于平稳。另有资料表明，细胞的死亡方式(坏死或凋亡)与刺激因素、刺激强度以及刺激时间密切相关[5-6]。因此本实验应用DAPI染色分别对不同培养时间的皮质神经元进行OGD刺激2 h引起的神经元死亡方式进行识别比较，以期找到引发较大凋亡率的方法。OGD刺激后，培养8天和培养12天的皮质神经元DAPI染色阳性率即显著增加，而培养6天的皮质神经元的DAPI染色阳性率并不高。由此可以说明：不同培养时间的皮质神经元对OGD刺激引起的细胞凋亡并不一样，成熟的皮质神经元细胞对OGD损伤敏感。这可能由于培养体系中缺乏在体模型中的清道夫细胞，使得凋亡细胞不能被清除而最终裂解，从而导致坏死率继发性的增高。

　　【参考文献】

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