腹腔注射内毒素对老年大鼠记忆保持功能的损害

　　作者：陈 正 张 焰 谈大海 作者单位：(苏州大学附属第四医院麻醉科，江苏 无锡 214062)

　　【摘要】 目的 探讨腹腔注射内毒素(LPS)对成年和老年大鼠记忆保持功能的影响。方法 按照析因设计的方法，将成年和老年雄性SD大鼠各32只随机分为4组：成年大鼠/生理盐水组(C组)、成年大鼠/LPS组(L组)、老年大鼠/生理盐水组(A组)和老年大鼠/LPS组(A+L组)，每组16只，然后每组随机取8只大鼠分别进行Morris水迷宫和Y迷宫训练，经训练获得记忆后24 h腹腔注射LPS250 μg /kg或等体积的生理盐水。给药后24 h进行记忆保持功能测试，水迷宫测试以达到平台前的游泳距离和Y迷宫测试以大鼠受到连续20次电击后进入安全区的正确反应次数作为观察指标，测试结束后立即取海马组织用酶联免疫吸附试验测定白细胞介素1β(IL1β)蛋白的表达。结果 年龄与LPS对大鼠到达平台前的游泳距离和受电刺激后正确反应次数的影响，各自的主效应有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，而交互作用无统计学意义(P>0.05);组间比较表明，A+L组较A组和L组大鼠到达平台前的游泳距离延长和受电刺激后正确反应次数减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，而L组与C组和A组与C组的差异无统计学意义(P>0.05)。年龄和LPS对海马IL1β蛋白表达的影响，各自的主效应有统计学意义(P<0.01)，且两者间的交互作用也具有统计学意义(P<0.01)，组间比较表明，L组大鼠海马IL1β蛋白表达高于C组，差异有统计意义(P<0.05)，A组与C组差异无统计学意义(P>0.05)，A+L组大鼠海马IL1β蛋白表达高于A组和L组，差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 腹腔注射LPS后老年大鼠记忆保持功能受损，而不影响成年大鼠的记忆保持功能，这与衰老加重LPS诱导的海马IL1β蛋白表达升高有关。

　　【关键词】 记忆保持;内毒素(LPS);老年;白细胞介素1β(IL1β);海马

　　外周免疫系统受到感染等刺激后，促炎细胞因子释放增加，激活免疫神经传导通路，导致中枢神经系统促炎细胞因子和外周一样表达增加，机体出现记忆功能减退〔1〕。研究表明，外周免疫激活后中枢促炎细胞因子的表达随着机体的衰老过程而改变，老年比成年机体增加更明显〔2〕，但外周免疫激活对成年和老年机体的记忆功能是否产生不同的影响还未见报道。我们应用腹腔注射内毒素(LPS)来模拟急性外周感染，刺激成年和老年大鼠的外周免疫系统，来研究外周免疫激活对成年和老年大鼠记忆保持功能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 3月龄和18月龄雄性SD大鼠(东南大学实验动物中心提供)，体重分别为250～350 g和650～750 g，饲养在温度24 ℃、湿度50%和明暗交替各12 h的环境中，自由进食和饮水。

　　1.2 试剂与仪器 LPS(血清型055:B5 Sigma)，大鼠白细胞介素1β(IL1β)ELISA试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司，酶标仪(芬兰Thermo公司)，Morris水迷宫视野分析系统和Y迷宫分别由上海吉量软件科技有限公司和张家港生物医学仪器厂提供。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物分组与给药 将成年和老年大鼠各32只随机分为4组：成年大鼠/生理盐水组(C组)、成年大鼠/LPS组(L组)、老年大鼠/生理盐水组(A组)和老年大鼠/LPS组(A+L组)，每组16只。然后每组随机取8只大鼠分别进行Y迷宫和水迷宫训练，整个训练结束24 h后腹腔注射LPS 250 μg /kg或等体积的生理盐水。

　　1.3.2 Y迷宫测试 将大鼠放入迷宫中适应5 min后，以所在的支臂为起始区给予电击(电压40～50 V)，大鼠受到电刺激后逃至安全区，灯光继续作用10 s，然后继续以所在的支臂作为下一次测试的起点进行第2次测试，依次重复，以无规则次序变换安全区，每天固定训练20次。大鼠足底通电后10 s内一次性跑向安全区为正确反应，当连续20次测试中有18次或以上正确反应时，表示达到学会标准，训练过程结束，记录大鼠达到学会标准所用的天数。腹腔给药24 h后，按照训练时的方法进行测试，以大鼠受到连续20次电击后进入安全区的正确反应次数作为记忆保持成绩。

　　1.3.3 Morris水迷宫测试 将水迷宫平分为4个象限，放置一圆形平台固定于某一象限中央，平台顶低于水面1 cm，迷宫上方安装有摄像机记录大鼠的运动轨迹，测试期间保持外参照物不变。大鼠先进行7 d的定位航行训练，每天进行4次，每次间隔1 min，大鼠随机从不同的象限入水点出发，大鼠找到平台后停留30 s，应用水迷宫视频分析系统进行处理，记录大鼠到达平台前的游泳距离，取4次测试的平均值作为每日的训练成绩，如在60 s内仍未找到，则将其引导至平台停留30 s，并记录60 s内的游泳距离，另外在训练期间记录大鼠的游泳速度。同样在腹腔给药24 h后，按照训练时的方法进行测试，记录大鼠到达平台前的游泳距离作为记忆保持成绩。

　　1.3.4 海马组织IL1β蛋白测定 应用酶联免疫吸附试验法行蛋白测定，记忆保持测试结束后立即断头处死大鼠，暴露颅腔迅速分离出两侧海马组织，先进行组织蛋白提取，将海马组织按50 mg/ml的比例加入组织裂解液，于冰浴上制作组织匀浆，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min后将上清转移到1.5 ml离心管里-70 ℃冰箱中保存。测定时取组织蛋白提取液100 μl，加至IL1β单抗包被的96孔板中，37 ℃孵育2 h，充分洗板后，加入生物素化的IL1β单抗，37 ℃孵育1 h，洗板后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，置37 ℃温箱30 min，洗板后加入底物37 ℃反应15 min，最后加入终止液，在450 nm处测定OD值，根据标准曲线得出IL1β含量，然后除以用Bradford法测定得到的提取液总蛋白浓度，作为海马组织IL1β蛋白表达量。

　　1.3.5 统计学处理 实验数据以x±s表示，应用SPSS13.0进行统计学分析，Y迷宫训练所观察指标的比较采用t检验，水迷宫训练所观察指标的比较采用重复测量资料方差分析(组间因素为年龄，组内因素为时间)，记忆保持测试成绩和海马组织IL1β蛋白表达采用两因素的方差分析(一因素为年龄，另一因素为LPS)，当两因素具有交互作用或各自主效应有统计学意义时，应用StudentNewmanKeuls法进行组间两两比较。

　　2 结 果

　　2.1 Y迷宫测试 老年大鼠达到学会标准的时间(8.9±1.7)d较成年大鼠(5.1±1.0)d延长，差异有统计学意义(P<0.01)。记忆保持测试中，年龄与LPS对大鼠受电刺激后正确反应次数的影响，各自的主效应有统计学意义(P<0.05)，而交互作用无统计学意义(P>0.05)，组间比较表明，A+L组较A组和L组大鼠受电刺激后正确反应次数减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，而L组与C组和A组与C组的差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

　　2.2 Morris水迷宫测试 年龄和时间对大鼠7 d训练中到达平台前的游泳距离的影响具有统计学意义(P<0.05)，而两者间的交互作用无统计学意义(P>0.05)，训练每个时间点的组间比较，第1 ～5 d老年较成年大鼠游泳距离长，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，而第6和7天两者间差异无统计学意义(P>0.05)(见表2);年龄对大鼠训练中游泳速度的影响具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，而时间的影响及年龄和时间的交互作用无统计学意义(P>0.05)，训练每个时间点的组间比较，整个训练过程老年较成年大鼠游泳速度慢，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。记忆保持测试中，年龄与LPS对大鼠到达平台游泳距离的影响，各自的主效应有统计学意义(P<0.01,P<0.05)，而交互作用无统计学意义(P>0.05)，组间比较表明，A+L组较A组和L组到达平台前的游泳距离延长，差异具有统计学意义(P<0.05)，而与C组比较，L组和A组均无显著性变化(P>0.05)(见表2)。　表1 腹腔注射内毒素对成年和老年大鼠记忆保持功能

　　2.3 海马IL1β蛋白表达 年龄和LPS对海马IL1β蛋白表达的影响，各自的主效应有统计学意义(P<0.01)，且两者间的交互作用也具有统计学意义(P<0.01)。组间比较表明，L组大鼠海马IL1β蛋白表达高于C组，差异有统计意义(P<0.05)，A组与C组差异无统计学意义(P>0.05)，A+L组大鼠海马IL1β蛋白表达高于A组和L组，差异有统计学意义(P<0.01)(见表1)。表2 成年和老年大鼠7 d水迷宫训练中到达平台前的游泳距离和速度与成年大鼠比较：1)P<0.05，2)P<0.01

　　3 讨 论

　　本研究表明，腹腔注射LPS后老年大鼠记忆保持功能受损，而不影响成年大鼠的记忆保持功能，这与衰老加重LPS诱导的海马IL1β蛋白表达升高有关。

　　Morris水迷宫和Y迷宫训练阶段，老年大鼠表现出较成年大鼠减退的学习记忆功能〔3〕，但经过一段时间的训练后，老年与成年大鼠一样能够达到Y迷宫测试的学会标准，并且与成年大鼠到达平台前的游泳距离没有差别。大鼠获得相应记忆功能后，经腹腔注射LPS损害了老年大鼠的记忆保持功能，而对成年大鼠没有影响。在水迷宫测试中，我们没有选择常用的到达平台前的潜伏期作为观察指标，这是因为腹腔注射LPS后可致大鼠的运动速度减慢〔4〕，如选择潜伏期作为学习记忆指标，易夸大LPS的效应，因此在本研究中选择游泳距离作为大鼠的学习记忆成绩。

　　外周促炎细胞因子释放增加，激活免疫神经传导通路，致使中枢神经系统胶质细胞活化〔5〕，促炎细胞因子表达增加，与海马区细胞因子受体结合后抑制长时程增强和损害学习记忆功能，在外周免疫激活诱导的记忆障碍中，海马组织IL1β表达增加起着重要作用〔6〕。在中枢神经系统，衰老过程中胶质细胞呈现出激活状态的表型特征，例如，小胶质细胞补体iC3b受体(CD11b)、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHC Ⅱ)和星形胶质细胞酸性纤维蛋白(GFAP)表达增加〔7，8〕，体外培养的老年大鼠中枢胶质细胞受到LPS刺激后，促炎细胞因子水平高于成年大鼠〔9〕，上述的原因可解释本研究中年龄和LPS对IL1β表达的影响具有的交互作用，老年和成年大鼠IL1β基础表达水平没有差别，但腹腔注射LPS后，老年大鼠海马IL1β表达升高比成年大鼠更明显，因此衰老加重了LPS诱导的海马IL1β表达升高。成年大鼠应用LPS后海马IL1β表达升高，尽管有统计学意义，但只升高1倍，可能尚不能影响记忆保持功能，这与本研究中应用LPS剂量较小有关，在Jain等〔10〕的研究中LPS用量达2 mg/kg，削弱了成年大鼠的记忆功能。

　　在临床上，老年患者外周感染后出现急性认知功能障碍(记忆保持是认知功能的一部分)〔11〕，也验证了本研究的结果，如何减轻老年患者感染后的认知功能减退值得进一步的研究。

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　　11 Laurila JV，Laakkonen ML，Tilvis RS,et al.Predisposing and precipitating factors for delirium in a frail geriatric population〔J〕.J Psychosom Res，2008;65(3): 24954.