局部应用重组水蛭素治疗脑出血后脑水肿的实验研究

作者：时宏娟，沈霞，荣良群，魏秀娥  关键词  脑出血　　摘要 :目的  探讨局部应用凝血酶特异性抑制剂（重组水蛭素）治疗脑出血后保护机制。 方法  成年雄性SD大鼠随机分为生理盐水组、脑出血组和水蛭素组（出血后3h）。以50μl自体血注入大鼠尾状核方法建立脑出血模型，应用干-湿重法观察脑水肿变化，前肢放置实验观察行为学。每组每时相点（1、2、3、7、14、28天）各6只大鼠。 结果  脑出血组和水蛭素组脑含水量与生理盐水组在24h、48h、72h比较P<0.05，7天时各组间无明显差异（P>0.05）;脑出血组大鼠前肢放置实验结果与生理盐水组比较（P<0.05），水蛭素组与脑出血组比较P<0.05。 结论  脑出血后24～48h水肿达高峰;重组水蛭素可明显减轻脑水肿，同时可以改善脑出血后的神经功能缺损。　　关键词 :脑出血;重组水蛭素;脑水肿　　Experimental study on local administration of recombinant hirudin for brain edema in rat models of intracerebral hemorrhage  　　SHI Hong-juan，SHEN Xia，RONG Liang-qun，et al　　（Department of Neurology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China）    　　Abstract:Objective To investigate the protective effect and mechanism of local recombinant hirudin（thrombin inhibitor）on experimental intracerebral hemorrhage（ICH）in rats.Methods SD rats were randomly divided into saline control group，ICH control group and treatment group（with hirudin applied3hours after ICH）.ICH model was established by injecting50μl of autologous blood into the caudate nucleus.At6time points（1d，2d，3d，7d，14d and28d after ICH），the behavioral as-sessments by Vibrassae-stimulated forelimb placing and the estimate of brain edema by dry-wet weighing method，were per-formed.Results Significant differences in cerebral edema were found between saline and ICH controls and between ICH and treatment groups at1d，2d and3d（P<0.05），but no such differences among the three groups were noticed any more at7d and14d.Behavioral assessments at all of the6time points，showed the scores of the treatment group were superior to those of the ICH control group，but still inferior to that of the saline control.Conclusion The brain edema reaches its peak48h after ICH.The edema and neurological deficits can be obviously improved when recombinant hirudin is applied early after ICH，sug-gesting that it is theoretically rational to use local recombinant hirudin for ICH.    　　Key words:intracerebral hemorrhage;hirudin，recombinant;brain edema       　　既往研究表明，脑出血后局部血肿分解释放的某些活性物质或血液本身的成分可能对脑组织具有损害作用，其中凝血酶在出血后脑水肿形成中起关键作用［1］ 。本研究通过超早期局部应用凝血酶特异性抑制剂重组水蛭素，动态观察脑水肿的变化，结合行为学评分，评价重组水蛭素对急性出血性脑损伤的保护作用。

　　1 材料和方法     　　1.1 材料 

　　1.1.1 动物 健康成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠108只，体重220～250g，由徐州医学院实验动物中心提供。    　　1.1.2 仪器 动物立体定位仪（江湾二型）;100μl微量进样器（浙江省医用器械厂）;远红外快速恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）;电子分析天平（HR2140，美国，精密度0.0001g）;OLYMPUS光学显微镜（日本）。

　1.1.3 主要试剂与药品 重组水蛭素（美国Sigma公司），用生理盐水配成2×10 6 U/L（2U.μl）冻存备用。10%水合氯醛、PBS及其他相关试剂均为国产分析纯级，购自徐州医学院设备处。

　　1.2 方法     　　1.2.1 动物分组 大鼠随机分为生理盐水组、脑出血组、水蛭素组，脑出血组只进针不注药，治疗时间点为出血后3h，水肿测量时间点为出血后1、2、3、7、14天，行为学观察时相为出血后1、2、3、7、14、28天，各组各时相点6只大鼠。    　　1.2.2 模型制备与处理 参照Yang等［2］ 报道的方法改进，根据“大鼠脑立体定位图谱”［3］ 确定尾状核的位置:前囟前0.2mm，矢状缝向右3.0mm，深6.3mm为注射点。大鼠经10%水合氯醛（350mg.kg）腹腔麻醉俯卧位固定于立体定位仪上，头皮正中消毒后矢状位切开约1.5cm，暴露前囟点，据图谱调整立体定位仪于注射点（A0.2mm，L3.0mm，V6.3mm），钻颅打孔（直径约1mm）将鼠尾置于40℃水温浴10min后取出擦干消毒，距离鼠尾末端3cm处剪断，用微量进样器吸取新鲜血液约50μl，迅速插入已钻好孔内，进针6.3mm（相当于尾状核位置），注射时间不少于15min，留针10min缓慢退针，钻孔用骨蜡封闭，局部碘伏消毒后，缝合切口皮肤。大鼠清醒后无偏瘫体征（Longa评分）或血液沿针道反流者弃用。水蛭素组在造模成功后3h原位固定后予以5μl水蛭素注射液（约含10U）。大鼠在各时间点分别进行行为学测试后处死测量脑水肿。

　　1.2.3 行为学评价 行为学测试通过触须诱发大鼠前肢放置实验［4］ ，每只大鼠每个前肢重复刺激10次，记录触须刺激后前肢恰当放置于工作台面的次数所占百分数。应注意抓鼠姿势规范化谨防被鼠咬伤，测试者对大鼠采用双盲法。    　　1.2.4 脑含水量测定（干-湿重法） 各时相点动物断头处死后迅速取出全脑，置于冰台上，去除小脑和脑干。取进针点前后3mm脑组织块，分别称其湿重后置于100℃恒温干燥箱24h后称其干重，脑含水量=（湿重-干重）.湿重×100%。     　　2 结果     　　2.1 各组各时相点脑含水量测定结果  见表1。

　　表1  各组各时相点脑含水量测定结果（略）    　　与同时相点生理盐水组比较:#P<0.05;与同时相点脑出血组比较:△P<0.01

　　2.2 各组各时相点大鼠行为学测试成绩  见表2。     　　表2  各组各时相点前肢放置实验结果（略）    　　与同时相点生理盐水组比较:#P<0.05;与同时相点脑出血组比较:#△P<0.01     　　3 讨论       　　既往研究表明，多种机制参与出血后血肿周围脑水肿的形成，其中血液凝固过程中凝血酶的释放起关键作用［5］ 。早期的脑水肿（出血后24h内）可能是因为凝血酶激活PAR-1引起神经元轴突、树突和胶质细胞的突起回缩，造成细胞损伤。后期引起的脑水肿主要是凝血酶引起的血脑屏障破坏和红细胞溶解、血红蛋白及其代谢产物的综合作用。    　　水蛭素是已知作用最强的凝血酶特异性抑制剂［6］ ，它具有一个和凝血酶受体的某个区域类似的羧基尾部，与凝血酶以1∶1非共价键形成复合物，通过阻断凝血酶阴离子结合位点和催化位点而发挥作用。伴随基因时代的到来，人工合成水蛭素现已进入临床试验阶段。Peeling等［7］ 研究表明，脑出血血肿周围存在一个脑组织可逆性损伤的半暗带，可能与局部脑血流下降、脑水肿、炎症反应、细胞调亡等有关，故挽救出血后一段时间内（超早期时间窗<6h）血肿周围半暗带成为治疗的最终目的。目前还不知道脑出血后凝血酶的释放持续多长时间，考虑到脑出血同时凝血酶即迅速产生［8］ ，由于血脑屏障的破坏，血液中部分凝血酶进入血肿周围组织以及局部脑组织损伤后新的凝血酶原生成可能使血肿周边组织凝血酶含量进一步增多;故本实验选择出血后3h局部应用重组水蛭素。

　本实验研究表明，出血后脑水肿与神经功能缺损评分有密切的时间相关性:出血组大鼠神经功能缺损以术后2～3天最严重，随着时间的进展，缺损逐渐有所恢复（出血后28d>50%），这种变化与术后2～3天脑水肿达高峰致脑损伤严重有关。超早期（出血后3h）出血灶局部应用重组水蛭素与同时相脑出血组相比较，水蛭素通过特异性抑制凝血酶的作用，可显著减轻早期的脑水肿，并可长期（1～28天）改善神经功能缺损，明显降低出血后致残率，改善预后。    　　尽管目前研究聚焦在凝血酶介导的脑出血水肿的形成上，其他如血块退缩、红细胞、血红蛋白等崩解产物［9］ 、自由基的生成等均在不同时段脑水肿产生中发挥作用，因而尽管重组水蛭素可显著减轻脑水肿并改善神经功能，如果和其他药物如自由基清除剂等联合应用于脑出血，有可能达到最佳治疗效果，至于联合用药剂量与用药时机，有待进一步深入研究。

　　参考文献 :    　　［1］ Lee KR，Kawai N，Kim S，et al.Mechanisms of edema formation after intracerebral hemorrhage:effects of thrombin on cerebral blood flow，blood-brain barrier permeability，and cell survival in a rat model［J］.J Neurosurg，1997，86（2）:272-278.    　　［2］ Yang GY，Bets AL，Chenevert TL，et al.Experimental intracerebral hemorrhage:relationship between brain edema，blood flow，and blood-brain barrier permeability in rats［J］.J Neurosurg，1994，81（1）:93-102.    　　［3］ 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京:人民卫生出版社，1991:35.    　　［4］ Hua Y，Schallert T，Keep RF，et al Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Stroke，2002，33（10）:2478-2484.    　　［5］ Lee KR，Colon GP，Betz AL，et al.Edema from intracerebral hemor-rhage:the role of thrombin［J］.J Neurosurg，1996，84（1）:91-96.

　　［6］ 赵 彦，刘发益.凝血酶在中枢神经系统中的毒性和保护双重作用［J］.国外医学?生理、病理科学与临床分册，2003，23（1）:70-73.    　　［7］ Siddique MS，MendelowAD.Surgical treatment of intracerebral haem-orrhage［J］.Br Med Bull，2000，56（2）:444-456.    　　［8］ Mutch NJ，Robbie LA，Booth NA.Human thrombi contain an abun-dance of active thrombin［J］.Thromb Haemost，2001，86（4）:1028-1034.    　　［9］ Xi G，Keep RF，Hoff JT.Erythrocytes and delayed brain edema forma-tion following intracerebral hemorrhage in rats［J］.J Neurosurg，1998，89（6）:991-996.