降纤酶对大鼠局灶性脑缺血/再灌注血管内皮细胞超微结构及MMP2和9表达的影响

　　作者：王路平 王虎山 麻海春 饶明莉 作者单位：(吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 130021)

　　【摘要】 目的 观察降纤酶对大鼠局灶性脑缺血/再灌注(I/R)血管内皮细胞(VEC)的保护作用。方法 通过光镜、电镜来观察降纤酶对大鼠局灶性脑I/R VEC超微结构的改变以及采用免疫组织化学技术观察基质金属蛋白酶(MMP)2和9的表达。结果 在缺血3 h/6 h、6 h再灌组在缺血中心区及周边区VEC和神经细胞的损伤程度明显较降纤酶组重;I/R 3 h/6 h、I/R 6 h以及I/R 6 h/3 h组在缺血半影区模型组比降纤酶组MMP9表达增强(P<0.05)， 而MMP2变化不明显。I/R 24 h、I/R 3 h/24 h和I/R 6 h/24 h在缺血半影区降纤酶组较盐水对照组MMP9表达弱，而MMP2表达增强(P<0.05)。结论 降纤酶对局灶性脑缺血VEC具有保护作用。

　　【关键词】 降纤酶;脑缺血;血管内皮细胞;基质金属蛋白酶

　　The effect of Defibrase on the ultrastructure of cerebrovascular endothelial cell and expression of MMPs after focal cerebral ischemia /reperfusion in rats

　　WANG LuPing，WANG HuShan，MA HaiChun,et al.

　　Department of Anesthesiology，the First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，Jilin，China

　　【Abstract】 Objective To study the effect of Defibrase on the ultrastructure of cerebrovascular endothelial cell (VEC) and expression of MMPs after focal cerebral ischemia /reperfusion(I/R) in rats.Methods The rat model of focal cerebral ischemia with middle cerebral artery occlusion (MCAO) was established.Defibrase was used for investigating effects of ultrastructure of VEC and expression of MMPs.The sequential pathological changes in ischemic core and penumbra at different I/R time.Immunohistochemistry was used to examine MMP2 and 9.Results After 6 h of ischemia，the edema around VEC became more marked，degeneration and necrosis increased.The structure of VEC was injuried.Apoptosis in penumbra was saw，and the number of apoptotic cells was the largest at 24 h of cerebral ischemia.The expression of MMP9 decreased dramatically in Defibrase group in ischemia penumbra at 3 h/6 h，6 h/0 h，6 h/3 h compared with those in model group at the same time(P<0.05).Conclusions Defibrase has some protective effect on VEC after focal cerebral ischemia in rats.

　　【Key words】 Defibrase;Cerebral ischemia;Vascular endothelial cell;Matrix metalloproteinases

　　降纤酶是一种蛋白水解酶，具有降低纤维蛋白原活性，起到预防血栓再形成和溶栓，改善脑微循环，减轻脑水肿的作用，已应用于临床并有较好疗效〔1〕。而脑血管内皮细胞(VEC)损伤是脑缺血损伤最直接、最基本原因〔2〕。降纤酶是否对脑VEC具有保护作用目前还不十分清楚。本实验拟观察降纤酶对大鼠局灶性脑缺血/再灌注(I/R)基质金属蛋白酶(MMP)2和9表达的影响，来探讨降纤酶对脑缺血VEC的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组 健康雄性Wistar大鼠，鼠龄3～4个月，体重250～300 g，吉林省药检所实验动物中心提供。随机分成：大脑中动脉栓塞(MCAO)模型组(分别为缺血3 h/0 h、3 h/3 h、3 h/6 h、3 h/24 h、6 h/0 h、6 h/3 h、6 h/6 h、6 h/24 h和缺血24 h各6只;给予生理盐水)、假手术组(除不插线外，其余步骤同模型组)6只和降纤酶组(分组同模型组;于栓塞同时腹腔注入降纤酶8 U/kg，降纤酶由深圳海王生物工程有限公司提供，为冻干粉针剂，4℃冰箱保存，使用时用生理盐水稀释)。

　　1.2 大鼠病理学改变 ①光镜：各组大鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔，16号针头插入大鼠左心室，剪开右心房，首先灌入0.9%的温生理盐水约250 ml，待右心房流出清亮液体时换用含4%多聚甲醛的凉PBS(0.01 mol/L，pH7.4)灌注液约250 ml，取脑，以视交叉和其后4 mm处两点冠状切片，片厚4 mm并将两片脑片放入相同灌注液中固定6 h，常规梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片5 μm厚，HE染色，观察组织学改变。②电镜：缺血6 h组和假手术组大鼠的麻醉和灌注方法同光镜标本，待右心房流出清亮液体后，换用含2.5%戊二醛含4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS(pH7.4)的电镜灌注液灌注约250 ml，断头取脑，取大脑皮层和尾壳核各1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm置于4%戊二醛预固定，1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，制备半薄切片定位，超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。电镜观察，摄片。

　　1.3 免疫组织化学染色及图像分析 采用SP免疫组化法，兔抗VEGF多克隆抗体、小鼠抗MMP2、9单克隆抗体及SP试剂盒均购于福州迈新生物技术公司。按kit说明操作。胞浆含有可从背景中分辨出的浅黄色、棕色或棕褐色颗粒的细胞计为阳性细胞。将已染好的切片在显微镜下放大100倍，随机选含血管但不重叠的5个视野，统计阳性细胞数量并在计算机下测定其灰度，取其平均值。

　　1.4 统计学处理 数据用x±s表示，采用SPSS11.0进行方差分析和t检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠脑组织病理学改变 降纤酶组可见MCAO 3 h纹状皮质18区、梨状前皮质区和尾壳核区可见散在的几个嗜伊红神经细胞及少量核固缩的神经细胞，血管中可见VEC略显水肿，随缺血时间延长神经细胞和VEC胞浆水肿程度逐渐地加重。I/R 3 h、6 h再灌组可见神经细胞肿胀脱失，VEC明显水肿，血管周围无渗出的红细胞，二者损伤较单纯缺血组重。模型组可见MACO 3 h纹状皮质18区、颞叶、梨状前皮质和尾壳核区可见少量神经元深染和部分胞质淡染水肿神经元，同时可见VEC水肿。VEC及神经细胞随缺血时间的延长细胞损伤逐渐地加重。I/R 3 h/6 h神经细胞肿胀脱失，VEC明显水肿，在缺血中心区和周边区均可见部分血管已破损，周围可见大量红细胞渗出。降纤酶组在细胞损伤程度上均明显轻于同一缺血时间模型组。假手术组在皮层区和尾壳核区可见大致正常的神经细胞和VEC。

　　2.2 各组大鼠脑VEC超微结构变化 缺血6 h降纤酶组：神经细胞仅有轻度肿胀，细胞器形态基本正常，毛细血管VEC水肿较轻，细胞膜完整，VEC间紧密连接正常。缺血6 h模型组：神经细胞高度肿胀，细胞器溶解，毛细血管VEC高度肿胀，细胞空化，其细胞膜缺损，VEC间紧密连接松弛。假手术组：神经细胞和毛细血管VEC结构完整，未见细胞明显水肿。

　　2.3 各组大鼠MMP2和9表达 在缺血0 h组和假手术组未见MMP2和9表达。在缺血3 h和I/R 3 h/3 h组，缺血中心区和缺血半影区MMP2和9均有少量表达，降纤酶组与模型组无明显差异。I/R 3 h/6 h、缺血6 h以及I/R 6 h/3 h组在缺血中心区可见MMP9和2较低水平的表达，降纤酶组与模型组比较无显著差异;而在缺血半影区可见MMP9表达，而MMP2表达较弱，模型组比降纤酶组MMP9表达增强而MMP2变化不明显。缺血24 h、I/R 3 h/24 h和I/R 6 h/24 h在缺血中心区和半影区均可见MMP2和MMP9的表达，在缺血半影区降纤酶组较模型组MMP9表达弱而MMP2表达增强，在缺血中心区两组比较无显著差异(图1，表1)。图1 模型组和降纤酶组缺血半影区MMP2及9表达(SP免疫组化，×20)表1 各组大鼠局灶性脑I/R缺血半影区MMP2，9表达

　　与模型组比较：1)P<0.05;与I/R 3 h/0 h 比较：2)P<0.01;与I/R 3 h/0 h比较、与I/R 6 h/0 h比较：3)P<0.01;与I/R 3 h/0 h比较： 4)P<0.05; 与I/R 6 h/0 h比较：5)P<0.01

　　3 讨 论

　　注射用降纤酶(Defibrase)是从蛇毒中经生物工程提纯的新型单组分的蛋白水解酶制剂，在经过几代蛇毒制剂的研制使用基础上进一步采用新工艺，去除了出血毒、神经毒等多种毒副作用，是一种更加完善的蛇毒制剂，具有抗凝、降纤、溶栓、扩张血管、改善微循环、降低血黏度、降低血脂及促进神经细胞恢复的作用，在治疗脑血栓方面已经取得了较好疗效〔1〕。

　　血脑屏障(BBB)主要由VEC吞饮作用、细胞质通道、细胞间紧密连接。而降纤酶能降低血液中纤维蛋白原的 Aα，生成可溶性纤维蛋白，并能间接促进血管内皮释放组织型纤维蛋白酶原激活物，并增强其作用，同时降低纤溶酶原激活剂抑制物的活性，减少纤溶抑制酶。因此能够改善脑微循环，抑制血栓形成，减轻脑水肿。本实验结果显示在缺血6 h模型组即有VEC结构的明显破坏，BBB已经开放，BBB的通透性增加，大量红细胞外渗，而降纤酶组无此改变。可能是脑缺血后激活MMP2和9系统，VEC基底膜被破坏，导致BBB结构受损，BBB开放，出现以血管源性为主的脑水肿，在脑梗死的发生、发展过程中起着非常重要的作用。而降纤酶组较模型组VEC损伤明显减轻，说明降纤酶对局灶性脑缺血VEC具有保护作用，可能是降纤酶对MMP系统有抑制作用，同时激活组织型纤溶酶原激活物(tPA)，进一步激活纤溶系统，改善脑微循环，减轻BBB的结构破坏，从而保护VEC及BBB。

　　MMP是一大类细胞外基质降解酶，MMP2和9在脑缺血后，通过蛋白水解作用破坏毛细血管紧密连接和基底膜，继而引起血管源性脑水肿。因此它们在脑血管病脑损伤过程中发挥了重要作用，促使BBB开放和脑水肿的形成。尤其是MMP2和9活性增加，与脑微血管通透性、BBB通透性、BBB崩溃、炎性细胞侵入和脑水肿明显相关，MMP9的表达与早期脑损伤有强相关性，而MMP2可能与损伤后组织修复有关〔3〕。Rosenberg等〔4〕报道早在脑缺血2 h后MMP2和9即通过消化脑微VEC基底膜，改变内皮细胞间的紧密连接，导致BBB开放。本实验表明降纤酶减轻VEC损伤并对半影区VEC和BBB有一定保护作用。而随着缺血时间延长，在半影区降纤酶组MMP9表达减弱，而MMP2表达增强。其机制可能是降纤酶能够抑制MMP系统〔5〕，减轻VEC基底膜破坏，同时促使缺血半影区血管修复，促使新生血管形成，从而保护BBB。

　　因此，在脑梗死的治疗过程中，只有早期及时地应用溶栓及降纤治疗，才能够恢复脑组织的血供，改善缺血半影区的微循环，改善BBB功能，减轻脑VEC损伤。

　　【参考文献】

　　1 Yi GL，Wang BS，Tang FM,et al.Dynamic changes in fibrinogen levels of patients with acute cerebral infarction after taking defibrase〔J〕.Neural Regener Res，2008;3(5)：2124.

　　2 Petty MA，Wettstein JG.Elements of cerebral microvascular ischaemia〔J〕. Brain Res Brain Res Rev，2001;36(1):2334.

　　3 Fujimura M，Gasche Y，Morita Fujimura Y,et al.Early appearance of activated matrix metalloproteinase9 and bloodbrain barrier disruption in mice after focal cerebral ischemia and reperfusion〔J〕.Brain Res，1999;842(1)：92100.

　　4 Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases in brain injury〔J〕.J Neurotrauma，1995;12(5):83342.

　　5 Rosenberg GA，Cunningham LA，Wallace J,et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain：activation of MMP9 linked to stromelysin1 and microglia in cell cultures〔J〕.Brain Res,2001;893(12):10412.