电刺激大鼠束旁核对脚内核神经元自发放电的影响

作者：宋 英武静茹 ，高东明

【关键词】  脑深部,电刺激;,束旁核;,脚内核

     摘要 :目的  观察不同频率电刺激束旁核（PF）对正常大鼠、帕金森病（PD）模型鼠脚内核（EP）神经元自发放电的影响，探讨不同频率电刺激PF对EP神经元活动的调节作用。 方法  采用单管玻璃微电极细胞外记录方法，记录不同频率电刺激PF对正常和PD状态下大鼠EP神经元自发放电频率和模式的影响。 结果  PD模型鼠的EP神经元自发放电频率较正常大鼠增加20.34%（P<0.01）。高频刺激（强度0.4mA，波宽0.1ms，时程5s，频率130Hz）PF使93.65%正常大鼠及96.30%PD模型鼠的EP神经元放电活动受到抑制，且抑制效应时程具有频率依赖性。 结论  高频刺激PF可以减少基底神经节输出核团EP神经元的活动。

　　关键词 :脑深部　电刺激;　束旁核;　脚内核

     activities of the entopeduncular nucleus in rats

    SONG Ying，WU Jing-ru，GAO Dong-ming

    （Department of Anestheticophysiology，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221000，China）

    Abstract:Objective To observe the effect of electric stimulation of the parafascicular nucleus（PF）on the neuronal ac-tivities of the entopeduncular nucleus（EP），in order to confirm the efficacy of deep brain stimulation（DBS）of the PF on Par-kinson disease and probe into the mechanism underlying DBS.Methods Extracellular recording was used to monitor the changes in firing rate and pattern of the EP in response to the electric stimulation of varied rates to the PF in normal and model rats.Results The autonomic firing rate of the EP was higher（by20.34%，P<0.05）in PD model rats than in normal rats.High-frequency electric stimulation on the PF inhibited the neural activities in the majority of EP neurons in normal rats（93.65%）and in PD rats（96.30%）.The inhibitory duration was proportional to the frequency of the electric stimulation. Conclusion DBS on PF can reduce the overactivity of EP in the basal ganglia.

    Key words:deep brain stimulation;parafascicular nucleus;entopeduncular nucleus

    帕金森病（Parkinson disease，PD）是常见的中枢神经系统慢性退行性疾病。在PD病理状态下，包括苍白球内侧核〔在大鼠为脚内核（EP）〕、黑质网状部（SNr）和丘脑底核（STN）在内的运动系统环路具有病理性神经活动是其重要的特性，最终引起运动减少、肌强直、平衡障碍和姿势异常等PD症状。束旁核（PF）是丘脑髓板内核群后群的一组核团，长期以来，人们一直关注PF在疼痛治疗方面的作用，但最近的一些研究显示丘脑PF和基底神经节不同核团间有密切的纤维联系，并参与运动的调节1］ 。许多学者认为PF可能是一个有效的治疗PD的核团，目前国外的一些医疗机构已经尝试脑深部电刺激（DBS）PF来治疗PD患者的运动症状，但是对PF和基底神经节间的纤维联系，以及PF如何参与运动调节的研究尚属于开始阶段。本实验用电生理方法， 进一步探讨不同频率电刺激大鼠PF对EP神经元放电的影响。

　　1 材料和方法

    1.1 实验动物  成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只，体重250～300g，由锦州医学院实验动物中心提供，随机分为2组，正常组25只，PD模型组15只。

　　1.2 实验方法

    1.2.1 PD大鼠模型的制备 采用纹状体两点注射法制备PD大鼠模型。大鼠腹腔麻醉后，头颅水平位固定在脑立体定位仪上，参照《Paxinos&Watson大鼠脑图谱》，确定右侧纹状体（STR）两点坐标:①A-1.0mm，L2.5mm，H4.7mm;②A0.26mm，L3.2mm，H5.2mm。用微型电动颅骨钻分别开直径2mm骨窗，用微量注射器每点注射3μl6-羟基多巴胺（6-OHDA，由含0.2%抗坏血酸的生理盐水配制而成，浓度为5g.L）。术后用牙托粉封闭颅骨孔，缝合筋膜和皮肤，腹腔注射氨苄青霉素，置于笼内正常饲养。术后第4周在大鼠颈部皮下注射阿朴吗啡（APO）0.5mg.kg（浓度0.5g.L），诱发大鼠旋转行为，记录时间为40min，平均转数达7r.min者为成功PD大鼠模型。

    1.2.2 电生理学实验 将大鼠用乌拉坦（0.8μl.100g）腹腔麻醉，固定在脑立体定位仪上，在颅骨PF和EP对应区各开一骨窗，暴露脑组织，借助微电极推进器将同心圆电极（NEX-100型，外径0.25mm，直流阻抗3～6MΩ）推进至PF核（坐标:AP-4.22mm，RL1.20mm，H5.70mm），电刺激通过恒流刺激器（蚌埠无线电厂），刺激隔离器输出。电刺激参数为:单脉冲，波宽0.1ms，刺激强度0.4mA，刺激时程为5s。神经元放电用单管玻璃微电极进行细胞外记录，电极尖端直径小于2μm，电阻5～15MΩ，玻璃管内灌注含1%膀胺天蓝的3.0mol.L NaCl溶液引导神经元放电，借助微电极推进器将其推入EP区（AP-2.56mm，RL2.65mm，H7.00～7.80mm），记录到的神经元单位放电经微电极放大器，前置放大器引导、滤波，显示于示波器上并输入计算机经SMUP生物信号系统（上海第一医科大学）处理，结果自动生成序列密度直方图。观察在不同电刺激频率（1Hz，10Hz，50Hz，80Hz，100Hz，130Hz，150Hz，180Hz，200Hz，250Hz，300Hz和500Hz）下EP神经元自发放电频率的变化。

    电刺激前后的神经元放电频率变化根据下面公式判断:R=刺激后放电频率-刺激前放电频率刺激前放电频率 ×100% R>+20%为兴奋型反应，R<-20%为抑制型反应，介于两者之间为无反应。

    1.3 统计学处理  所得数据应用SPSS11.5统计软件处理，数据资料以ˉx±s表示，用t检验进行差异显著性比较。检验水准:α=0.05。

    2 结 果

    2.1 PD大鼠模型的建立  大鼠经STR注射6-OHDA术后第4周颈背部皮下注射APO进行旋转行为检测，记录时间40min，平均为（9.00±1.58）r.min，最高可达27r.min。同时伴有以健侧后肢为支点，身体向健侧环曲，原地旋转，多伴有竖毛、易激惹、尾僵直、觅食和嗅探行为。建立典型PD模型。

　　 2.2 电生理实验结果

    2.2.1 电刺激PF对正常大鼠EP神经元自发放电的影响 实验中共记录了正常大鼠63个神经元自发放电，其放电较规则，多为单个放电，很少见爆发性串放电，频率较快，均大于10Hz，在11～28Hz之间，平均为（18.34±3.67）Hz。PF高频刺激抑制了大多数EP神经元（59.63，93.65%）的放电活动，平均放电频率由刺激前的（18.34±3.67）Hz减少到（11.49±4.71）Hz（P<0.01）。电刺激停止后，放电频率没有立即恢复到正常水平，有明显的后作用，平均抑制时程为（22.86±3.33）s（图1）。另有1个神经元兴奋，3个神经元没有反应。随后刺激强度固定在0.4mA，观察了抑制时程和刺激频率的关系。记录了52个神经元对不同频率电刺激的反应，刺激频率小于80Hz时没有明显的反应，在80～200Hz时随着刺激频率的增加对EP神经元的抑制作用时间逐渐增强，该作用具有频率依赖性，EP的抑制时程与刺激频率成明显呈相关（Y=7.88+0.12X，r=0.96），大于200Hz抑制时程不再随刺激频率的增加发生明显变化（图2）。

  　　2.2.2 电刺激PF对PD大鼠EP神经元自发放电的影响 PD大鼠记录到54个EP神经元放电，自发放电频率显著加快，平均为（22.07±4.74）Hz，较正常大鼠增加了20.34%（P<0.01），放电形式变得不规则，可见爆发式放电。高频刺激PF使96.30%（52.54）的EP神经元表现出了与正常大鼠相似的抑制反应，平均放电频率由（22.07±4.74）Hz减少到（11.82±4.28）Hz（P<0.01），刺激的后作用明显，抑制时程从17.26s到30.26s，平均抑制时程为（24.18±3.81）s（图3）。还有1个单位兴奋，1个单位无反应。与正常大鼠比较，2组的抑制时程无显著性差异（P>0.05）。二者的神经元反应类型亦无统计学差异（χ2 =0.75，P>0.05）。

　　3 讨 论

    PD是一种以黑质-纹状体通路退行性变为主要特征的神经系统变性疾病，其产生原因是由于黑质致密区（SNc）多巴胺能神经元变性，导致黑质纹状体通路破坏及尾状核、壳核中多巴胺含量减少，通过直接和间接通路使基底神经节传出结构EP和SNr活动过强，即EP.SNr神经元放电过多，从而增加了对丘脑-皮质的抑制，出现运动不能和运动徐缓等临床症状［2］ 。Porter等［3］ 在实验中发现黑质多巴胺能神经元变性后，基底节的输出核EP和SNr的琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶的活性均增高，显示二者神经元活动确有增强。本研究观察到，经STR注射6-OHDA导致中脑SNc损毁4周后的PD大鼠EP的自发放电频率较正常大鼠增加了20.34%，且放电模式变得极不规则，多表现为爆发性放电和混合性放电，这些结果与文献报道基本一致［4］ 。PF是丘脑髓板内核群后群的一组核团，研究显示，PF和基底神经节不同核团间有密切的纤维联系，并参与运动的调节［5］ 。一般认为，DBS产生与损毁相似的效应，但作用机制目前尚不十分清楚，认为刺激直接抑制神经元细胞从而减少或抑制电刺激附近神经元的活动。本实验中观察到，高频刺激PF抑制了正常 大鼠EP神经元的放电频率，说明高频刺激通过抑 制PF神经元而间接抑制EP神经元放电活动，PF和EP间有纤维联系，且PF对EP的作用是兴奋的。Orieux等［7］ 用化学的方法研究发现，PD大鼠PF的代谢活性明显增高;有学者认为PD状态下的EP活性增高与PF的兴奋性驱动有关。近期国外有报道，在灵长目的PD模型或PD患者中，损毁或高频刺激PF可以减轻震颤和L-Dopa诱导的异动症［6］ 。本实验中观察到高频刺激PF抑制PD大鼠EP神经元的放电活动，推测在PD状态下，能通过减少EP神经元异常放电活动，降低其抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）对丘脑及相关核团的抑制，释放丘脑-皮质环路活性从而改善PD症状。

    在实验中我们进一步观察到低频率电刺激大鼠PF，正常和PD大鼠的EP神经元放电活动无显著变化，逐渐增大刺激频率至80Hz时，神经元的放电活动出现了抑制效应，且刺激频率在80～200Hz间随着频率的增加，抑制时程逐渐延长。结果显示，应用电刺激PF治疗PD时使用较高的刺激频率是必要的。

　　 参考文献 :

    ［1］ Mouroux M，Feger J.Evidence that the parafascicular projection to the  subthalamic nucleus is glutamatergic［J］.Neuroreport，1993，4（6）:613 -615.

    ［2］ 徐德隆，陈生弟.帕金森病临床新技术［M］.北京:人民军医出 版社，2002:164.

    ［3］ Porter RH，Greene JG，Higgins DS Jr，et al.Polysynaptic regulation of glutamate receptors and mitochondrial enzyme activities in the basal ganglia of rats with unilateral dopamine depletion［J］.J Neurosci，1994，14（11Pt2）:7192-7199.

    ［4］ Burbaud P，Gross C，Benazzouz A，et al.Reduction of apomorphine-  induced rotational behaviour by subthalamic lesion in6-OHDA le-sioned rats is associated with a normalization of firing rate and discharge pattern of pars reticulata neurons［J］.Exp Brain Res，1995，105（1）:48-58.

    ［5］ Baldi G，Russi G，Nannini L，et al.Trans-synaptic modulation of stri- atal ACh release in vivo by the parafascicular thalamic nucleus［J］.Eur J Neurosci，1995，7（5）:1117-1120.

    ［6］ Caparros-Lefebvre D，Blond S，Feltin MP，et al.Improvement oflevodopa induced dyskinesias by thalamic deep brain stimulation is re-lated to slight variation in electrode placement:possible involvement of the centre median and parafascicularis complex［J］.J Neurol Neuro- surg Psychiatry，1999，67（3）:308-314.

    ［7］ Orieux G，Francois C，Feger J，et al.Metabolic activity of excitatory parafascicular and pedunculopontine inputs to the subthalamic nucleus in a rat model of Parkinson′s disease［J］.Neuroscience，2000，97（1）:79-88.

      （1.徐州医学院麻醉生理学教研室，江苏徐州221002;2.锦州医学院生理学教研室，辽宁锦州121001）