氯胺酮对糖尿病大鼠神经功能及神经病理痛的作用

作者：王燕，柯昌斌，周小峰，罗向红，李元涛    作者单位：1.郧阳医学院附属太和医院麻醉科，湖北十堰442000； 2.南方医科大学附属深圳市妇幼保健院麻醉科，广东深圳518028

【摘要】  目的 探讨氯胺酮对糖尿病大鼠神经功能及神经病理痛的疼痛作用。方法 雌性Wistar大鼠24只，体重180～220 g，随机分为3组(n=8)：正常组(N组)、糖尿病神经病理性痛组(D组)、氯胺酮组(K组)。D组、K组腹腔注射链脲菌素65 mg/kg制作糖尿病神经病理痛模型，大鼠自由进食饮水饲养4周。自第5周开始， K组大鼠腹腔注射10 mg/kg氯胺酮，1次/d，持续4周。随后测定各组大鼠机械痛阈值(MWT)、神经传导速度（NCV）。并用砂罗铬花青法行神经髓鞘染色和缓冲亚甲蓝法进行尼氏体染色。应用ELISA法测定脊髓内超氧化物歧化酶（SOD）、 丙二醛（MDA）含量。结果 D组脊髓和DRG神经元的尼氏体体积减小，并且有尼氏体的脱失和溶解。坐骨神经的髓鞘存在不同程度的水肿，空泡样变性，结构紊乱和局灶性脱失。K组髓鞘及尼氏体病变明显减轻。与N组比较，D、K组大鼠MWT、NCV、SOD降低,MDA升高（P＜0.05）；与D组比较，K组大鼠MWT、NCV、SOD升高，MDA降低（P＜0.05）。结论 氯胺酮通过抗氧化对糖尿病神经病理痛大鼠有神经保护及疼痛治疗作用。

【关键词】  糖尿病神经病变；疼痛；氯胺酮

Role of ketamine on the nerve function and neuropathic pain in diabetic rats

    WANG Yan1, KE Changbin1, ZHOU Xiaofeng1, LUO Xianghong1, LI Yuantao2

    (1.Department of Anesthesiology, Affiliated Taihe Hospital of Yunyan Medical College, Shiyan, Hubei 442000，

    China; 2.Department of Anesthesiology, Affiliated Shenzhen Maternal and Child Health Care Hospital of Southern

    Medical University, Shenzhen, Guangdong 518028)

    Abstract: Objective  To investigate the role of ketamine on the nerve function and neuropathic pain in diabetic rats. Methods  24 female Wistar rats weighing 180-220 g were randomized into 3 groups (n=8): normal control group (group N), diabetic neuropathic pain group (group D) and ketamine group (group K). Diabetic neuropathic pain model was induced by intraperitoneal streptozocin 65 mg/kg in groups D and K, in which rats were housed with food and water ad libitum for 4 weeks. From the 5th week the rats in group K received ketamine 10 mg/kg intraperitoneally once a day for another 4 weeks. At the end of the 8th week, mechanical withdrawal threshold (WMT) and nerve conduction velocity (NCV) were measured. Myelin sheath of sciatic nerve and Nissl bodies in neurons were demonstrated with staining of solechrome cyanin and buffered methylene blue, respectively. The levels of superoxide dismutase (SOD) and malonaldehyde (MDA) in the spinal cord were assayed by ELISA. Results  The Nissl bodies in the spinal cord and the DRG neurons were observed to have pyknosis, accompanied by collapse and karyolysis of Nissl body. The myelin sheath of the sciatic nerve was characterized by edema of different degrees, vacuole-like denaturation, structural derangement and local demyelination. The neuropathies in myelin sheath and Nissl body were markedly attenuated in group K. Compared with group N, the levels of WMT, NCV and SOD were lower and MDA level higher in groups D and K (P<0.05), while the comparison between the latter two groups revealed that groups K had higher levels of WMT, NCV and SOD and the lower MDA level. Conclusion  Ketamine protects nerve and relieves the painful symptoms of neuropathic pain in diabetic rats by its antioxidative effect.

    Key words: diabetic neuropathies; pain; ketamine

    糖尿病性神经病变是临床上糖尿病最常见的并发症之一，目前临床上尚无有效的治疗手段。氯胺酮(ketamine,K)是临床上常用的静脉麻醉药，研究表明氯胺酮有神经保护和疼痛治疗作用［1-4］，但对糖尿病神经病理痛是否有作用尚不清楚。本实验拟探讨氯胺酮对糖尿病神经病理痛的镇痛以及神经保护作用。

    1  材料和方法

    1.1  动物模型  雌性Wistar大鼠24只，3月龄，由武汉大学医学院实验动物中心提供，体重180～220 g，随机分为3组(n=8)：正常组(N组)、糖尿病神经病理性痛组(D组)和氯胺酮组(K组)。D组、K组禁食、禁饮12 h后，腹腔单次注射链脲菌素(批号：380-010-M100，Alexis公司,美国)65 mg/kg制作糖尿病神经病理痛模型，大鼠自由进食饮水饲养4周。自第5周开始， K组大鼠腹腔注射10 mg/kg氯胺酮，1次/d，持续4周。C组、D组腹腔注射等体积生理盐水。

    1.2  指标测定  采用标准化von Frey纤维丝(Stoelting公司，美国)参照文献［3］的up-down法测定各组大鼠后足的机械缩足反应阈值(mechanism withdraw  threshold， MWT)。采用Cantata型肌电图仪(Dantec公司，丹麦），测定神经传导速度（nerve conductive velocity， NCV）。大鼠腹腔注射3%的水合氯醛10 ml/kg麻醉后，显露左侧坐骨神经。刺激电极放置在坐骨神经干中部，记录电极放置在腓肠肌中部。刺激条件：低频滤波20 Hz，高频滤波10 kHz，刺激间期0.2 ms。记录各复合动作电位潜伏期，计算传导时间，并测量刺激电极与记录电极之间沿神经走向的距离，计算运动神传导速度：NCV(m/s)=距离/传导时间。

    将大鼠置于冰板上取右侧坐骨神经，L4、5的背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）和脊髓，迅速置于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚3 μm。用砂罗铬花青法行神经髓鞘染色和缓冲亚甲蓝法进行尼氏体(Nissl body)染色。然后在光镜下观察髓鞘病变程度及尼氏体脱失情况。

    另取L1、2脊髓,称重后在冰浴下将组织匀浆，高速离心后取上清液,按ELISA试剂盒说明,测定超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的相对含量。

    1.3  统计学处理  用SPSS 13.0统计软件进行处理,计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    与正常组相比，糖尿病神经痛大鼠脊髓和DRG神经元的尼氏体体积减小，并且有脱失和溶解。砂罗铬花青染色见糖尿病神经痛大鼠的坐骨神经的髓鞘存在不同程度的水肿，空泡样变性，结构紊乱和局灶性脱失。氯胺酮组髓鞘病变及尼氏体脱失情况明显减轻。

    与N组比较，D组与K组大鼠NCV、MWT和SOD下降，MDA升高（P<0.05）；与D组比较，K组大鼠NCV、MWT和SOD升高，MDA下降（P<0.05）。见表1。表1  各组NCV、MWT、SOD和MDS的比较

    3  讨  论

    临床上糖尿病神经病理性痛的症状主要表现为自发的持续性疼痛和感觉异常，实验室检查可发现糖尿病神经病理性痛患者均有不同程度的神经功能障碍。在实验研究中，将糖尿病动物痛阈降低作为糖尿病神经病理性痛模型制备成功的标准［5-6］。本研究中糖尿病大鼠机械痛阈明显下降，即存在糖尿病神经病理性痛； NCV是评价神经功能的主要方法［7-9］，本实验中观察到糖尿病神经病理性痛大鼠NCV明显下降，说明存在神经功能障碍。因此本研究成功建立了糖尿病神经病理性痛模型，并能较好地模拟临床糖尿病神经病理性痛的病理改变。

    尼氏体是神经元内蛋白质合成的场所，其数量的多少、体积的大小及分布反映神经元合成蛋白的能力及是否受损。本实验中，糖尿病神经病理性痛大鼠神经元的尼氏体数量减少、体积缩小，并发生边积、溶解和脱失，提示神经元合成蛋白能力低下和一定程度的损伤。神经元的损伤和蛋白合成能力的减弱可能导致某些神经营养物质合成减少，这也许是神经结构和功能的损伤的一个重要因素。髓鞘结构的完整性是保证有髓神经纤维结构和功能完整性的重要生理基础，因此髓鞘的结构改变就成了神经纤维病理改变的重要标志。在本实验中观察到糖尿病大鼠的坐骨神经髓鞘结构紊乱，出现不同程度的水肿、空泡样变性和局灶性脱失。说明糖尿病大鼠存在明显的神经病理性改变，这可能是糖尿病神经病理性疼痛发生的病理基础。

    MDA是组织中脂质过氧化反应的分解产物，与组织缺血性损伤有关；其含量常常反映机体细胞脂质过氧化的严重程度；损伤越严重，其含量越高；是反应机体内氧化状态的指标。SOD是体内氧自由基清除剂之一，对机体的氧化与抗氧化平衡有着至关重要的作用，能够通过催化消除氧自由基起到阻碍活性氧的产生，从而保护细胞的正常功能的作用。在本实验中观察到糖尿病神经病理性痛大鼠脊髓内MDA显著升高，说明在糖尿病神经病理性痛的发生过程中,脊髓内有脂质过氧化反应,并产生了大量的氧自由基；而SOD水平明显降低，表明脊髓的氧自由基清除能力明显下降。而过度的氧化应激反应是糖尿病各种并发症的重要发病机制，因此糖尿病大鼠脊髓内氧化及抗氧化的失衡可能是糖尿病神经病理痛的发病机制。

    氯胺酮作为苯环已哌啶的衍生物，在临床广泛用于小儿麻醉、静脉麻醉及复合麻醉。它是N-曱基-D-天冬氨酸(NMDA)受体非竞争性拮抗剂，可以拮抗周围神经受损引起兴奋性氨基酸的毒性和减少NMDA受体介导的Ca2+内流，具有一定的神经保护作用。本实验中糖尿病神经病理性痛大鼠经过1个月的氯胺酮处理后，与糖尿病大鼠相比，尼氏体溶解、脱失和边集现象明显减轻，数量明显增多，同时髓鞘的病变程度也明显减轻，NCV也明显增加。说明氯胺酮可以改善神经元的蛋白合成功能，修复受损的髓鞘，改善神经传导功能，对糖尿病神经病理痛大鼠有很好的神经保作用。同时，氯胺酮处理后可以观察到糖尿病神经病理痛大鼠的械痛阈明显升高，说明氯胺酮对糖尿病神经病理性痛有确切的疼痛治疗作用。另外，在氯胺酮处理后观察到糖尿病神经病理痛大鼠脊髓内SOD含量明显升高，而MDA含量明显下降，说明氯胺酮减轻了氧化激反应，同时也增强了机体抗氧化作用，稳定了机体的氧化抗氧化的平衡。这可能是氯胺酮对糖尿病神经病理痛的神经保护及疼痛治疗作用的机制。但从实验结果看，氯胺酮并没有完全逆转糖尿病神经病理痛的各项病理生理改变，说明氧化及抗氧化作用的失衡是糖尿病神经病理痛发病机制之一，其确切的发病机理有待深入研究，而氯胺酮用于糖尿病神经病理痛的治疗也只是一个选择，完全治愈糖尿病神经病理性痛还需有效的综合措施。

    综上所述，氯胺酮能够增强机体对氧自由基的清除能力，可能通过抗氧化起到一定的神经保护和疼痛治疗作用。

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