神经细胞黏附分子在胶质细胞系源性神经营养因子保护多巴胺能神经元中的作用

作者：王红军，刘红梅，王炎强，曹俊平，高殿帅 【关键词】  神经细胞　　摘要 :目的  研究神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）在胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）保护1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）损伤的多巴胺（dopamine，DA）能神经元中的作用。 方法  以原代培养的小鼠腹侧中脑神经细胞作为观察对象，实验分4组:空白对照组、MPTP组（在无血清培养基内加入10μmol.L MPTP）、GDNF+MPTP组（在无血清培养基内加入GDNF保护的基础上，再加入MPTP）、抗-NCAM+GDNF+MPTP组（在无血清培养基内加入NCAM封闭抗体阻断GDNF保护作用的基础上，再加入MPTP）。采用免疫细胞化学染色技术，观察各组酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、钙结合蛋白D28K（calbindin D28K，CB）表达的变化。 结果  MPTP组TH阳性神经元胞体明显小于空白对照组;CB阳性神经元数目减少，有统计学意义。GDNF+MPTP组TH阳性神经元胞体与MPTP组有明显差别;CB阳性神经元数目与MPTP组有显著性差异。抗-NCAM+GDNF+MPTP组上述指标与MPTP组无显著性差异。 结论  NCAM参与了GDNF保护DA能神经元的作用，该保护作用可能是通过增加CB的表达而完成的。　　关键词 :多巴胺能神经元;胶质细胞系源性神经营养因子;1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶;钙结合蛋白D28K;神经细胞黏附分子　　The role of NCAM in the mechanism of GDNF protection of dopaminergic neurons　　WANG Hong-jun，LIU Hong-mei，WANG Yan-qiang，et al　　（Department of Neurobiology，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China）   　　Abstract:Objective To explore the possible role of neural cell adhesion molecule（NCAM）in mediating the protective effect of glial cell line-derived neurotrophic actor（GDNF）on dopaminergic（DA）neurons in the mesencephlic cell culture in-jured by1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP）.Methods Primary culture of ventral mesencephalic neurons was established.The neurons were studied in four groups:normal control group，MPTP control group，MPTP plus GD-NF test group，and anti-NCAM plus MPTP and GDNF test group.On the8th day，TH and CB immunohistochemistry was per-formed.The morphologic indexes were measured and statistic analysed.Results The long diameter of TH positive neurons in the MPTP control group was significantly shorter than that in the normal control group.The density of CB positive neurons was al-so decreased in the MPTP injury control group.GDNF could protect the DA neurons against the injury of MPTP.However，the protective effect of GDNF on DA neurons was canceled，when the NCAM pathway was blocked by adding anti-NCAM in the fourth group of the present experiment.Conclusion NCAM can mediate the protective effect of GDNF on DA neurons，and this role may be related to the increase of CB expression.    　　Key words:dopaminergic neurons;glidal cell line-derived neurotrophic factor;1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tet-rahydropyridine;calbindin;neural cell adhesion molecule       　　中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元参与控制自主运动，它们的变性坏死是帕金森病（Parkin-son disease，PD）的主要病理特征［1］ 。如何保护这些容易受到损伤而变性死亡的DA能神经元成为PD 治疗研究的热点之一。

　胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）于1993年由Lin等人首次分离纯化胶质细胞系，其对多巴胺能神经元的保护作用已为众多学者所证实［2～4］ ，但其保护作用机制如何，目前尚不明确。      　　介导GDNF信号转导的通路有Ret依赖性和Ret非依赖性两大类［5］ ，最新研究表明在Ret非依赖性信号通路中，神经细胞黏附分子（neural cell adhe-sion molecule，NCAM）可能发挥了重要作用［6］ 。NCAM是一种广泛存在于神经细胞膜上的黏附分子，若能与GDNF结合并起作用，将为探讨GDNF的作用机制提供重要依据。Kolkova等［7］ 发现GDNF可通过NCAM活化下游的Fyn、FAK，促进突起的生长。但NCAM信号通路是否能影响GDNF对DA能神经元的保护作用还不明确。另有研究表明，含CB的DA能神经元具有较强的抗变性能力，那么NCAM是否能够影响CB的表达，从而在GDNF保护多巴胺能神经元中发挥了作用?本实验以小鼠腹侧中脑神经元原代培养为模型，通过阻断NCAM的作用，结合TH、CB免疫细胞化学技术，观察GDNF对中脑DA能神经元的作用，探讨NCAM在GDNF保护MPTP损伤的DA能神经元中的作用，为临床治疗PD提供理论依据。     　　1 材料和方法     　　1.1 试剂  人重组GDNF，Sigma公司;1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP），Sigma公司;Anti-NCAM，Sigma公司;Neurobasal medium，Gibco公司;B27，Gibco公司;胎牛血清（FBS），Hyclone公司;小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体（一抗），Sigma公司;小鼠抗大鼠钙结合蛋白D28K（calbindin D28K，CB）抗体（一抗），Sigma公司。

　　1.2 中脑神经细胞培养  取胚胎17.5天（E17.5）昆明小鼠全脑，置于冰盒上，体视显微镜下分离腹侧中脑，用DMEM漂洗3遍，剪碎后，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，37℃水浴15min。用含10%胎牛血清的DMEM终止消化，巴斯德吸管轻柔吹打15下，400目滤网过滤，1000r.min离心5min，弃上清，用含10%FBS+1%B27的DMEM.F12重悬，以2×105 密度接种于预先铺被多聚赖氨酸的24孔培养板内，置37℃、5%CO2 、平衡湿度的标准培养箱内培养。24h后更换为无血清培养基（Neurobasal TM  medium，含2%B27，4mmol.L谷氨酰胺），隔2天半量换液。     　　 培养的第2天，将细胞分为4组:空白对照组、MPTP组、MPTP+GDNF组、NCAM通路阻断组（加抗-NCAM，30min后加GDNF）。即于第2～8天加入 GDNF，阻断剂在加GDNF前30min加入，MPTP在第3天加入，48h后（第5天）换为不含MPTP的无血清培养基。第8天，行TH、CB免疫组织化学。各处理因子及试剂使用的终浓度如下:GDNF为20μg.L;抗-NCAM为20mg.L;MPTP为10μmol.L。抗-NCAM为NCAM的封闭性抗体，可以特异性封闭NCAM的胞外区，从而阻断由NCAM介导的信号传递。     　　1.3 TH、CB免疫组织化学  将细胞用4%多聚甲醛固定，室温15min，3%H 2 O 2 封闭内源性过氧化物酶，室温10min，10%封闭用羊血清，含0.03%Triton X-100，37℃，1h，鼠抗TH抗体（一抗），1∶1000，鼠抗CB抗体（一抗），1∶1000，抗体稀释液稀释，4℃过夜，37℃复温1h;对照滴加0.01mol.LPBS代替一抗，生物素结合的羊抗小鼠IgG，1∶50，37℃，2h，辣根过氧化物酶标记的生物素卵白素复合物，37℃，1h，DAB室温下反应1～2min。倒置显微镜下观察，拍照。     　　1.4 结果分析  利用光学显微镜，在低倍到高倍等不同的倍数下观察各组TH阳性细胞形态。每孔细胞取6个视野，计数阳性细胞数，用计算机辅助图像分析系统对各组的CB表达阳性细胞进行定量分析。

　1.5 统计学处理  使用单因素方差分析程序，分别对均数两两间进行比较和显著性检验，P<0.05有显著性差异。     　　2 结果     　　2.1 TH免疫细胞化学染色结果  TH为DA能神经元特异性的标志酶，本实验以光学显微镜下TH阳性神经元的形态为指标评价NCAM在GDNF保护DA能神经元中的作用。空白对照组TH阳性神经元胞体大，胞质染色，核仁清晰，突起多而且长，呈树枝状，表现为健康神经元的形态。MPTP组为在无血清培养基内培养3天后，加入10μmol.L MPTP，作用48h后，换不含MPTP的新鲜培养基，继续培养48h，TH阳性神经元的形态发生了明显改变，与对照组相比，其胞体缩小，突起数目变少、长度变短，显示细胞受损。加MPTP24h前给予20μg.L GDNF，TH阳性神经元胞体与对照组相差不大，突起数目也多，与MPTP组相比，则有明显改善。抗-NCAM+MPTP+GDNF组，即加GDNF前30min，给予20mg.L抗-NCAM，TH阳性神经元胞体与对照组无明显差异，但突起显著减少;与MPTP组无明显区别。见图1。 　　图1  不同实验组TH阳性神经元形态的比较（略）    　　A:对照组;B:MPTP组;C:GDNF+MPTP组;D:抗-NCAM+GDNF+MPTP组（DAB法，bar:40μm）     　　2.2 CB免疫细胞化学染色结果  CB是细胞内Ca 2+ 的缓冲蛋白，可以降低Ca 2+ 介导的细胞毒性作用。本实验通过观察CB表达的变化，评价NCAM在GDNF保护DA能神经元中的作用。以单位面积内阳性细胞数为指标进行比较。在培养第3天加入10μmol.L MPTP，作用48h后，换不含MPTP的新鲜培养基，继续培养48h，CB阳性神经元数目（1.667±0.211）与对照组（4.667±0.494）相比明显减少，有统计学意义。在加MPTP24h前，给予20μg.L GDNF作为保护组，可使CB阳性神经元数目相应增加，与MPTP损伤组有统计学意义。阻断组为在加GDNF前30min，给予20mg.L抗-NCAM，24h后再给予MPTP，CB阳性神经元数目少于对照组，但与MPTP组无显著性差异。见图2，3。 　　图2  不同实验组CB的表达情况（略）    　　A:对照组;B:MPTP组;C:GDNF+MPTP组;D:抗-NCAM+GDNF+MPTP组（DAB法，bar:40μm）  　　图3  不同实验组CB的表达情况（略）     　　3 讨论       　　近几年，有2类治疗PD的方法极具前景，一类是通过移植DA能神经元直接替代死亡的或受损的神经元，另一类是利用神经营养因子阻止神经元死亡。目前，已发现多种神经营养因子能够促进中脑黑质致密部DA能神经元存活或阻止其变性，其中，GDNF是这些神经元最有效的存活因子之一。本实验也证实了这一点，当用MPTP损伤DA能神经元后TH阳性神经元形态发生很大改变，突起明显减少、缩短。加入GDNF后，损伤得到改善。      　　虽然GDNF对中脑黑质DA能神经元的促存活作用已经很明确，但是其具体的作用机制如何，目前还不清楚;而明确这一点，对于我们更好地利用这一因子至关重要。      　　介导GDNF信号转导的受体系统包括c-ret原癌基因编码的信号受体和GPI-锚定的结合受体，GDNF可通过Ret进行信号传递，该通路为Ret依赖性的。在一些没有Ret的组织里，GDNF也可以发挥生物学效应，即为Ret非依赖性的，据研究，NCAM在其中发挥了重要作用。NCAM是神经系统内主要的细胞黏附分子，由于其具有黏附性及传递信号的能力，因而它参与了包括细胞迁移、突起生长及突触的可塑性等许多发育过程。Paratcha等于2003年提出NCAM是GDNF家族的另一个信号受体，GDNF可以通过NCAM，进而活化胞内的Fyn、FAK，促进神经细胞突起的生长。本实验特异性阻断NCAM后，发现GDNF不能有效保护MPTP损伤的DA神经元，说明NCAM参与了GDNF对DA能神经元的保护作用。另外，近年来钙代谢及其体内平衡与老化及神经变性疾病之间联系的研究格外引人注目。有研究表明，含钙结合蛋白的DA神经元具有较强的抗变性能力。在本实验条件下发现，MPTP可使培养的中脑神经元内CB表达减少，而同时加入MPTP和GD-NF后，CB表达增加，说明GDNF可以通过促进神经元内CB的表达，缓冲细胞内Ca 2+ 浓度，降低Ca 2+ 介导的细胞毒作用。而阻断NCAM这一Ret非依赖性通路后，也阻断了GDNF使CB增加的作用，提示NCAM可能是通过增加CB的表达介导了GDNF对DA神经元的保护作用。      　　本实验从正反两方面研究了GDNF对DA神经元的保护可以通过NCAM这一Ret非依赖性通路发挥作用，为进一步探讨其作用机制提供了基础。

　　参考文献 :    　　［1］ Nunes I，Tovmasian LT，Siwa RM，et al.Pitx3is required for devel-opment of substantia nigra dopaminergic neurons［J］.PNAS，2003，100（7）:4245-4250.    　　［2］ Lin LF，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF:a glial cell line-de-rived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons［J］.Sci-ence，1993，260（5111）:1130-1132.     　　［3］ Beck KD，Valverde J，Alexi T，et al.Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the adult brain［J］.Nature，1995，373（6512）:339-341.    　　［4］ Tomac A，Lindqvist E，Lin LF，et al.Protection and repair of the ni-grostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo［J］.Nature，1995，373（6512）:335-339.    　　［5］ Trupp M，Scott R，Whittemore SR，et al.Ret-dependent and-inde-pendent mechanisms of glial cell line-derived neurotrophic factor sig-naling in neuronal cells［J］.J Biol Chem，1999，274（30）:20885-20894.    　　［6］ Paratcha G，Ledda F，Ibanez CF，et al.The neural cell adhesion mol-ecule NCAM is an alternative signaling receptor for GDNF family ligand［J］.Cell，2003，113（7）:867-879.    　　［7］ Kolkova K，Novitskaya V，Pedersen N，et al.Neural cell adhesion molecule-stimulated neurite outgrowth depends on activation of pro-tein kinase C and the ras-mitogen-activated protein kinase pathway［J］.J Neurosci，2000，20（6）:2238-2246.